CYP19A1及雌激素對(duì)阿爾茨海默病作用的研究.pdf

1、目的:
　　探究CYP19A1基因的過(guò)表達(dá)及雌激素對(duì)阿爾茨海默病細(xì)胞模型的影響，為闡述CYP19A1、雌激素與阿爾茨海默病的內(nèi)在關(guān)系提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1.取胎齡為18-19d的C57BL/6J胎鼠，分離海馬組織。采用胰酶消化法進(jìn)行原代培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，采用微管蛋白相關(guān)標(biāo)志物2(MAP2)及Hoechst33258免疫熒光染色鑒定海馬神經(jīng)元純度。
　　2.用Aβ25-35處理海

2、馬神經(jīng)元建立阿爾茨海默病細(xì)胞模型。設(shè)不同濃度梯度的Aβ25-35作用于海馬神經(jīng)元48h，用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性，確定Aβ25-35最佳AD模型造模濃度。
　　3.用不同濃度的17β-雌二醇作用加入到Aβ25-35處理的阿爾茨海默病細(xì)胞模型中，48h后用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性，以及用Hoechst33258染核檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。
　　4.利用模板質(zhì)粒H4134，采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增出CYP19A1基因片段;用限

3、制性內(nèi)切酶SpeⅠ-HF和XbaⅠ酶酶切pLenti-CMV-EGFP-P2A-MCS-3FLAG(H138)表達(dá)載體;使用無(wú)縫克隆試劑盒將CYP19A1基因片段和線性化載體連接;運(yùn)用PCR方法鑒定陽(yáng)性克隆的pLenti-CMV-EGFP-P2A-CYP19A1載體。使用Obio轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行慢病毒包裝，運(yùn)用定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)法行滴度檢測(cè);并用重組慢病毒轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞(293T)，觀察GFP表達(dá)并用Western Blot檢測(cè)目

4、的質(zhì)粒的表達(dá)情況。從而構(gòu)建CYP19A1過(guò)表達(dá)慢病毒。
　　5.CYP19A1過(guò)表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染海馬神經(jīng)元，72h后用Aβ25-35處理造模。48h后，用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性，用Hoechst33258染核檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。
　　成果:
　　1.本課題所采用方法培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元生長(zhǎng)狀態(tài)良好，且能穩(wěn)定存活至3w;神經(jīng)元的純度可達(dá)95％。
　　2.穩(wěn)定建立了海馬神經(jīng)元阿爾茨海默病細(xì)胞模型，確立Aβ25-35的造模濃

5、度為20uM。
　　3.10-4 mol/L、10-5mol/L濃度17β-雌二醇可對(duì)抗Aβ25-35處理的海馬神經(jīng)元阿爾茨海默病細(xì)胞模型的活性損傷和細(xì)胞凋亡，對(duì)海馬神經(jīng)元有保護(hù)作用。
　　4.成功獲得了陽(yáng)性克隆的pLenti-CMV-EGFP-P2A-CYP19A1載體。并成功轉(zhuǎn)染了293T細(xì)胞，目的質(zhì)粒在細(xì)胞中成功表達(dá)。成功構(gòu)建了CYP19A1過(guò)表達(dá)慢病毒。
　　5.CYP19A1過(guò)表達(dá)慢病毒能在海馬神經(jīng)元中成功轉(zhuǎn)