阿爾茨海默病的一級(jí)預(yù)防研究——白藜蘆醇及花生根粗提物對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　 阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是老年人群中常見的一種神經(jīng)退行性變所致的癡呆疾患,主要表現(xiàn)為認(rèn)知功能障礙。近年來,隨著社會(huì)結(jié)構(gòu)老齡化,老年癡呆引起了廣泛的關(guān)注。根據(jù)美國(guó)阿爾茨海默病官方網(wǎng)站提供的數(shù)據(jù)顯示,在美國(guó)和歐洲的癡呆患者中,50％～80％患者的癡呆類型為AD。阿爾茨海默病協(xié)會(huì)2008年公布的最新統(tǒng)計(jì)顯示,美國(guó)每年由于AD以及其他類型癡呆直接或間接產(chǎn)生的醫(yī)療保健費(fèi)用高達(dá)89

2、0億美元。我國(guó)中國(guó)老年保健協(xié)會(huì)調(diào)研發(fā)現(xiàn),在上海等發(fā)達(dá)城市,AD的發(fā)病率正以每年1.4％的速度上升。我國(guó)AD患者約占全球患者的四分之一,高達(dá)到600-700萬人。因此,對(duì)于AD的預(yù)防與治療是當(dāng)前老年人群保健急需要解決的問題。對(duì)該疾病的預(yù)防不僅提高老齡人群的生存質(zhì)量,促進(jìn)人類健康；同時(shí)也可減輕由該疾病造成的醫(yī)療負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),而對(duì)于穩(wěn)定社會(huì)的基本單位--家庭也是至關(guān)重要的。
　　 AD主要病理特征為相對(duì)特異性的老年斑(senile

3、plaques,SP)生成、神經(jīng)元纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles,NTFs)和神經(jīng)元的丟失。研究表明,氧化應(yīng)激與AD病理過程密切相關(guān)。氧自由基是機(jī)體正?；虍惓４x過程如β淀粉樣蛋白聚集等現(xiàn)象所產(chǎn)生,生成的氧自由基可攻擊蛋白質(zhì)、核酸和生物膜,導(dǎo)致線粒體損傷和鈣超載等現(xiàn)象,造成神經(jīng)細(xì)胞損傷。近年來,大量的研究結(jié)果已將氧化應(yīng)激引起的神經(jīng)退行性病變和細(xì)胞凋亡置于AD研究的中心位置。
　　 B淀粉樣蛋白(beta

4、-amyloid,Aβ)是老年斑的主要成分,其沉積可誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞通過不同的途徑產(chǎn)生活性氧和氧自由基,引起細(xì)胞氧化損傷。而星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)量最多的一種細(xì)胞,其數(shù)量大約為神經(jīng)元的十倍。由于其呈網(wǎng)絡(luò)分布,并廣泛參與神經(jīng)系統(tǒng)的突觸信號(hào)傳遞和處理,所以當(dāng)其對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用失代償后,整個(gè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷將出現(xiàn)瀑布效應(yīng),最終導(dǎo)致神經(jīng)元的損害、認(rèn)知功能障礙以及AD患者的多種行為與心理癥狀。因此,尋找一種具有抗氧化活性和抗自由基損傷作用

5、,同時(shí)毒副作用又較小的有效物質(zhì),已經(jīng)成為AD一級(jí)預(yù)防的一個(gè)重要切入點(diǎn),也是開發(fā)抗AD新藥的重要途徑。天然的植物提取物目前被認(rèn)為是最佳的尋找途徑。其中,白藜蘆醇具備了抗氧化等特性,同時(shí)也是天然的植物提取物之一。因此,本文從無土花生根中提取的白藜蘆醇粗品,研究其對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用。
　　 白藜蘆醇(Resveratrol,Res),是來源于植物中的天然多酚類物質(zhì),廣泛存在于虎杖、花生、葡萄等植物中,其化學(xué)名3,5,4’-三羥基

6、反式芪(3,5,4’-trihydroxystilbene),一般為反式白藜蘆醇,它常與順式異構(gòu)體及白藜蘆醇甙(resveratrol glucoside)共同存在。其體內(nèi)的作用主要包括抗細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化、清除氧自由基、類雌激素等。在神經(jīng)保護(hù)作用方面,目前研究表明白藜蘆醇能有效的對(duì)抗中樞神經(jīng)缺血損傷,保護(hù)缺血區(qū)神經(jīng)元,減少梗死范圍,降低缺血再灌注所造成的遲發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞的凋亡,改善腦缺血引起的肢體運(yùn)動(dòng)功能障礙。白藜蘆醇對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用

7、已有較多研究,但目前的研究主要集中在神經(jīng)元上,對(duì)于星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響少見報(bào)道。
　　 結(jié)果
　　 一、星形膠質(zhì)細(xì)胞AD細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕?br>　　 運(yùn)用震搖方法對(duì)乳鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行純化,通過GFAP免疫組化染色鑒定,培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞純度>95％。采用不同濃度Aβ對(duì)細(xì)胞進(jìn)行損傷后,細(xì)胞處理同一時(shí)長(zhǎng),隨著Aβ濃度增加細(xì)胞存活率逐漸下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在同一Aβ濃度水平時(shí),細(xì)胞的存活率則隨

8、著損傷時(shí)間的延長(zhǎng)而下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中25 μmol/L Aβ處理24h實(shí)驗(yàn)組、50 μmol/L Aβ處理12h實(shí)驗(yàn)組,細(xì)胞存活率最接近50％,有利于后續(xù)試驗(yàn)中觀察白藜蘆醇是否具有保護(hù)作用,亦或是加劇損傷等；根據(jù)吖啶橙熒光染色分析細(xì)胞形態(tài)后發(fā)現(xiàn),25μmol/L Aβ處理24h實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞形態(tài)優(yōu)于50 μmol/LAβ處理12h實(shí)驗(yàn)組,及前者存活的細(xì)胞其細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞膜狀態(tài)優(yōu)于后者。因此,本次實(shí)驗(yàn)選用25μmo

9、l/L Aβ處理24h作為細(xì)胞損傷的條件。
　　 二、白藜蘆醇對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用
　　 (1)細(xì)胞存活率:Aβ?lián)p傷星形膠質(zhì)細(xì)胞后,細(xì)胞存活率急劇下降至51.84％,三組不同濃度(1、10、100μmol)的白藜蘆醇預(yù)處理細(xì)胞后,細(xì)胞存活率分別為54.23％、75.12％、85.98％,呈濃度劑量關(guān)系遞增。但1 μmol的白藜蘆醇對(duì)細(xì)胞保護(hù)作用無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；
　　 (2)LDH漏出量:收集上清液檢測(cè)LDH漏出

10、,結(jié)果顯示,10、100 μmol的白藜蘆醇較Aβ?lián)p傷組相比較,可減輕LDH的漏出,但1μmol的白藜蘆醇或加劇LDH漏出。提示10、100 μmol白藜蘆醇對(duì)細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。
　　 (3)ROS水平檢測(cè):熒光檢測(cè)顯示,蛋白損傷使得熒光強(qiáng)度增高(P<0.05),1 μmol/L RES處理組熒光強(qiáng)度大于Aβ處理組,其余兩組熒光強(qiáng)度均小于Aβ處理組(P<0.05)。結(jié)果表明10、100μmol/L RES可降低細(xì)胞損傷后胞內(nèi)

11、ROS水平,而1 μmol/L RES則提高了胞內(nèi)ROS水平,提示10、100μmol/L RES對(duì)AS工具有保護(hù)作用。
　　 (4)SOD、GSH-Px活性:裂解細(xì)胞,測(cè)定蛋白濃度后,對(duì)胞內(nèi)SOD、GSH-Px抗氧化酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示:Aβ?lián)p傷使得胞內(nèi)SOD及GSH-Px抗氧化酶活性降低,10、100 μmol白藜蘆醇處理組SOD活性較Aβ處理組有顯著提高,而1 μmol白藜蘆醇處理組SOD活性無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。1

12、、10、100 μmol白藜蘆醇處理組GSH-Px活力較Aβ處理組有不同程度的增加,呈濃度依賴關(guān)系遞增,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。由于1μmol白藜蘆醇處理組SOD與GSH-Px活性結(jié)果不一致,所以尚不能說明其對(duì)細(xì)胞是否具有保護(hù)作用。
　　 (5)丙二醛(MDA)濃度測(cè)定:不同濃度白藜蘆醇(1、10、100μmol)預(yù)處理星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞后,采用25 μmol/L Aβ對(duì)細(xì)胞進(jìn)行24h損傷,之后進(jìn)行MDA檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果

13、顯示:Aβ處理組處理組MDA濃度顯著高于正常對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；各白藜蘆醇濃度劑量保護(hù)組MDA濃度低于Aβ處理組,且隨著白藜蘆醇濃度的升高,MDA濃度呈現(xiàn)下降,各組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 三、無土栽培高產(chǎn)花生根系誘導(dǎo)白藜蘆醇
　　 利用生物誘導(dǎo)子等活性成分,對(duì)高產(chǎn)花生根系進(jìn)行誘導(dǎo)。薄層色譜法鑒定誘導(dǎo)前白藜蘆醇呈陰性、誘導(dǎo)后白藜蘆醇顯示陽性；高效液相色譜法(HPLC)定量結(jié)果,白藜蘆醇含量為4

14、80.975 μg/g DW,而野生花生根白藜蘆醇含量為51.23μg/g DW,轉(zhuǎn)基因番茄和轉(zhuǎn)基因萵苣白藜蘆醇含量分別為53μg/g DW、56.40μg/g DW。
　　 四、花生根粗提物對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用
　　 (1)粗提物無毒濃度篩選:cck-8法測(cè)定細(xì)胞存活率結(jié)果顯示:與正常對(duì)照組相比,粗提物濃度在10-2g/L及其更低濃度之后,細(xì)胞存活率沒有顯著性差異(P<0.05)。因此,本實(shí)驗(yàn)最終選取10-2g/L

15、、10-3g/L、10-4g/L三個(gè)濃度粗體進(jìn)行后續(xù)的細(xì)胞保護(hù)作用研究。
　　 (2)LDH漏出量:不同濃度粗提物(10-2g/L、10-3g/L、10-4g/L)預(yù)處理細(xì)胞,采用Aβ?lián)p傷細(xì)胞,之后檢測(cè)LDH含量。結(jié)果顯示:Aβ?lián)p傷可導(dǎo)致細(xì)胞LDH漏出量增加(P<0.05),三組濃度粗提物L(fēng)DH漏出量均較Aβ組有所減少(P<0.05),且濃度越高,LDH漏出量越少,組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示粗提物對(duì)細(xì)胞膜完整性

16、起到了一定的保護(hù)作用。
　　 (3)SOD、GSH-Px:SOD活性檢測(cè)結(jié)果顯示:與正常對(duì)照組相比,Aβ處理組SOD活性顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；10-2g/L、10-3g/L粗提物濃度組SOD活性較Aβ處理組增高(P<0.05),10-4g/L濃度組與Aβ處理組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 GSH-Px檢測(cè)結(jié)果顯示:Aβ處理組GSH-Px活性較正常對(duì)照組顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<

17、0.05)；10-2g/L、10-3g/L粗提物濃度組GSH-Px活性較Aβ處理組增高(P<0.05),10-4g/L濃度組與Aβ處理組、10-3g/L與10-4g/L濃度粗提物組,組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 提示10-2g/L、10-3g/L濃度的粗提物對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的氧化損傷具有保護(hù)作用。
　　 結(jié)論
　　 1、成功建立了星形膠質(zhì)細(xì)胞AD細(xì)胞模型；
　　 2、10、100 μmol/