卵清蛋白及金黃色葡萄球菌超抗原經(jīng)皮膚致敏BALB-c鼠的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：目前發(fā)現(xiàn)屏障功能減弱的皮膚上持續(xù)接觸各類(lèi)蛋白質(zhì)抗原引起炎癥性皮損，且伴隨總IgE及特異性IgE的升高，這種特殊的接觸性皮炎在特應(yīng)性皮炎(atopicdermatitis，AD)患者中發(fā)生率較高。本實(shí)驗(yàn)對(duì)BALB/c鼠腹部皮膚去除角質(zhì)層，造成的屏障功能受損，用卵清蛋白(ovalbumin，OVA)、金葡菌腸毒素A(StaphylococcalenterotoxinA，SEA)、金葡菌腸毒素B(Staphylococcalentero

2、toxinB，SEB)溶液的斑貼片經(jīng)皮膚致敏，研究致敏后可能引起的炎癥性皮損的組織學(xué)特點(diǎn)，同時(shí)檢測(cè)血清IgE水平、炎癥性皮損中代表性Th2/Th1細(xì)胞因子的mRNA的表達(dá)，研究其與AD的類(lèi)似性。 方法：1實(shí)驗(yàn)分組：32只BALB/c鼠隨機(jī)分為四組，分別用于制作OVA、SEA、SEB、生理鹽水(NS)經(jīng)皮膚致敏的動(dòng)物模型及陰性對(duì)照組。 2致敏過(guò)程：OVA溶于雙蒸水，配成100mg/mL濃度；SEA、SEB配成100μg/m

3、L濃度。第1周，小鼠腹部除毛，透明寬膠帶在除毛部位黏貼8次去除角質(zhì)層。20μLOVA/SEA/SEB溶液/生理鹽水滴加入斑試器內(nèi)的濾紙片，用消毒繃帶將斑試器固定于腹部皮膚，確保與皮膚緊密相貼。第1周內(nèi)每2～3天更換滴加新鮮溶液或生理鹽水的紙片，皮膚持續(xù)接觸溶液1周后取下斑試器。間隔2周，于第4周重復(fù)第1周給藥過(guò)程；再次間隔2周，于第7周再次重復(fù)第1周過(guò)程。 3標(biāo)本的收集：小鼠在第7周末以10﹪烏拉坦腹腔注射麻醉，直視下心臟取血，

4、離心取血清。取下與斑試器接觸部位皮膚，一部分投于10﹪甲醛溶液中固定，石蠟包埋，制成7μm切片，HE染色；另一部分投入液氮保存，用于RT-PCR。 4組織學(xué)改變：光鏡下觀察皮損組織的病理變化，每只小鼠的切片隨機(jī)取5處測(cè)定表皮和真皮的厚度計(jì)算，各組均值，比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組表真皮厚度。 5血清總IgE水平測(cè)定：采用酶聯(lián)免疫吸附法，操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)要求，顯色終止后立即在酶標(biāo)儀上測(cè)定450nm吸光度值(A)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，按曲

5、線換算各組樣本中血清IgE濃度，每個(gè)樣本設(shè)1個(gè)復(fù)孔。 6局部皮損組織中細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IFN-γmRNA表達(dá)水平測(cè)定(RT-PCR法)：取斑貼片接觸部位同等重量皮膚勻漿，提取總RNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定A260/A280比值確定無(wú)降解，反轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增后電泳，求得與內(nèi)參的吸光度比值，確定相對(duì)表達(dá)水平。 7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS11.0軟件分析，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)以(x)±s表示，實(shí)驗(yàn)組分別與對(duì)照組配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0.0

6、5時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果1癥狀學(xué)表現(xiàn)：各實(shí)驗(yàn)組小鼠第2周均出現(xiàn)明顯的搔抓，接觸斑試器部位出現(xiàn)紅斑，皮損在整個(gè)致敏過(guò)程中持續(xù)存在。OVA組所有小鼠在紅斑基礎(chǔ)上出現(xiàn)水腫、丘疹，至第6周OVA組部分小鼠局部出脫屑、表皮剝脫。SEA組、SEB組僅見(jiàn)紅斑、脫屑。生理鹽水組小鼠皮膚肉眼所見(jiàn)無(wú)明顯改變。 2病理改變：鏡下所見(jiàn)與NS組相比較，OVA組皮損有明顯表皮顆粒層增生，棘層肥厚，真皮內(nèi)血管擴(kuò)張充血，并見(jiàn)較多淋巴細(xì)胞為主的單

7、一核細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，部分炎癥細(xì)胞移入表皮層。真皮內(nèi)可見(jiàn)嗜酸性粒細(xì)胞。SEA組、SEB組亦可見(jiàn)表皮層增生，真皮內(nèi)少量淋巴-單一核細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，未見(jiàn)嗜酸性粒細(xì)胞。OVA組表皮和真皮厚度明顯增加。3血清IgE水平的改變：OVA組小鼠血清總IgE顯著上升(4852.677±1052.778pg/mL)，約為NS組(1080.873±366.772pg/mL)的四倍。SEA、SEB組IgE水平與NS組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)

8、。 4局部皮損組織中細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IFN-γmRNA表達(dá)水平：IL-4、IL-5、IFN-γ的擴(kuò)增片段分別與理論設(shè)計(jì)相符。與NS組相比，OVA組小鼠皮損中IL-4、IL-5的表達(dá)上調(diào)，差異顯著；SEA、SEB組小鼠皮損中3種細(xì)胞因子的表達(dá)水平，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)論1用100mg/mL的OVA在去除角質(zhì)層的BALB/c鼠經(jīng)皮致敏，能使之產(chǎn)生局部炎癥性皮損，伴隨血清總IgE水平升高，并且局部皮損中Th2型細(xì)胞因