結(jié)核分枝桿菌ESX-5分泌系統(tǒng)生物信息學(xué)分析及系統(tǒng)內(nèi)PE-PPE蛋白免疫生物學(xué)特性研究.pdf

1、結(jié)核病(tuberculosis，TB)仍然是世界范圍內(nèi)最嚴(yán)重的致死性疾病之一，全球約有1/3的人口感染結(jié)核桿菌，2012年新發(fā)的活動(dòng)性結(jié)核病人有860萬(wàn)人，并且有近130萬(wàn)人死于結(jié)核病，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康和公共衛(wèi)生安全。目前用于預(yù)防TB的唯一疫苗仍是卡介苗（Calmette-Guérin，BCG），但其免疫保護(hù)效果不佳，尤其針對(duì)成年人的肺結(jié)核，其免疫效果因地域不同呈現(xiàn)明顯差異(0％～80％)。一方面，非結(jié)核分枝桿菌的感染干擾了BCG的作

2、用;另一方面，在傳代減毒過(guò)程中，BCG丟失了編碼保護(hù)性抗原的基因序列，例如缺失了差異區(qū)域(region of difference，RD);此外，BCG作為一種減毒活疫苗，對(duì)于免疫力低下的人群，接種后將存在引發(fā)播散性結(jié)核病的隱患。因此更加理性地設(shè)計(jì)高效、安全的新型TB疫苗及尋求更為合理的抗TB免疫策略是亟待解決的研究課題，而這些都需要免疫學(xué)基礎(chǔ)上強(qiáng)有力的支撐，需要充分理解結(jié)核分枝桿菌的致病機(jī)理和免疫生物學(xué)特性，而尋找可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)

3、性免疫應(yīng)答的結(jié)核分枝桿菌蛋白、多肽是研發(fā)各種新型疫苗的基礎(chǔ)。
　　1.結(jié)核分枝桿菌ESX-5分泌系統(tǒng)生物信息學(xué)分析
　?、餍头置谙到y(tǒng)是近年來(lái)在結(jié)核分枝桿菌中發(fā)現(xiàn)的一種新型細(xì)菌分泌系統(tǒng)，由一些獨(dú)特的蛋白組分構(gòu)成，所有的分泌蛋白在分泌時(shí)彼此依賴(lài)，并且通過(guò)特定的途徑得以分泌。本研究對(duì)Ⅶ型分泌系統(tǒng)中的ESX-5分泌系統(tǒng)進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，直系同源搜索結(jié)果表明，在61株已測(cè)序的分枝桿菌中，恥垢分枝桿菌（Mycobacterium s

4、megmatis）、膿腫分技桿菌（Mycobacterium abscessus）、羅得西亞分枝桿菌（Mycobacterium rhodesiae）、楚布分分枝桿菌（Mycobacterium chubuense）、馬賽分枝桿菌（Mycobacterium massiliense）和新金分枝桿菌（Mycobacterium neoaurum）等6株分枝桿菌不含有ESX-5組分中任一蛋白的直系同源物，有48株分枝桿菌含有7個(gè)以上ESX-

5、5蛋白組分，其中有46株分枝桿菌含有11個(gè)以上ESX-5蛋白組分，通過(guò)分析每個(gè)蛋白組分在不同菌株的存在情況，發(fā)現(xiàn)Rv1787～Rv1792這個(gè)區(qū)段不是ESX-5分泌系統(tǒng)的核心組分;聚類(lèi)分析結(jié)果顯示，Rv1786、Rv1787、Rv1788、Rv1789、Rv1791、Rv1793等6個(gè)相鄰的組分屬于相同的聚類(lèi)，Rv1782、Rv1783、Rv1794、Rv1795、Rv1796、Rv1797、Rv1798等7個(gè)組分屬于相同的聚類(lèi)，而Rv

6、1785c、Rv1790、Rv1792這3個(gè)組分各為一類(lèi);Rv1782、Rv1783、Rv1795、Rv1796、Rv1797等蛋白含有跨膜螺旋;Rv1788、Rv1791、Rv1796等蛋白含有信號(hào)肽;Rv1782、Rv1783、Rv1785c、Rv1787、Rv1789、Rv1790、Rv1796、Rv1798等蛋白具有糖基化位點(diǎn);Rv1796(MycP5)是枯草桿菌絲氨酸蛋白酶，其酶解底物可能為Rv1795。這些數(shù)據(jù)將有助于對(duì)結(jié)核

7、分枝桿菌ESX-5分泌機(jī)制的深入研究，為結(jié)核病的預(yù)防、診斷和治療提供理論依據(jù)。
　　2.結(jié)核分枝桿菌ESX-5分泌系統(tǒng)內(nèi)PPE25和PE19蛋白T細(xì)胞表位的鑒定
　　結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv和缺失株H37Rv△ppe25-pe19尾部皮下免疫6周齡C57BL/6小鼠，免疫劑量為1×106 CFU/只，同時(shí)以未免疫小鼠為陰性對(duì)照，免疫3周后分離小鼠脾臟并制備脾細(xì)胞懸液，1×105cells/well鋪入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。

8、以合成多肽庫(kù)中的單個(gè)多肽分別刺激脾細(xì)胞進(jìn)行PEPSCAN實(shí)驗(yàn)（其中PPE25肽庫(kù)包括71條15肽，重疊數(shù)目為5個(gè)氨基酸;PE19肽庫(kù)包括29條15肽，重疊數(shù)目為3個(gè)氨基酸重疊），多肽終濃度為10μg/ml，刺激72h后ELISA方法測(cè)定細(xì)胞上清中IFN-γ含量。通過(guò)表位作圖的方法共鑒定出PPE25蛋白包括PPE25:1-20、PPE25:41-65、PPE25:186-200、PPE25:201-215、PPE25:236-255、PP

9、E25:281-295和PPE25:321-335等T細(xì)胞表位，其中PPE25:236-255、PPE25:281-295和PPE25:321-335是ESX-5分泌系統(tǒng)相關(guān)PPE蛋白的特異表位。PE19蛋白包括PE19:1-18、PE19:34-51和PE19:82-99等T細(xì)胞表位，其中PE19:1-18為ESX-5分泌系統(tǒng)相關(guān)PE蛋白的特異表位。這將為新一代疫苗設(shè)計(jì)和診斷試劑研發(fā)提供可靠的試驗(yàn)依據(jù)，為后期的工作奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

10、r>　　3.結(jié)核分枝桿菌PPE26蛋白MHC-Ⅰ T細(xì)胞表位的鑒定與PPE26:44-52 CD8+T細(xì)胞雜交瘤的制備
　　通過(guò)SYFPEITHI軟件對(duì)結(jié)核分枝桿菌ESX-5區(qū)域內(nèi)PE/PPE蛋白MHC-Ⅰ T細(xì)胞表位進(jìn)行預(yù)測(cè)，并對(duì)其中的PPE蛋白T細(xì)胞表位進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，在此基礎(chǔ)上通過(guò)T細(xì)胞雜交瘤技術(shù)將轉(zhuǎn)染了小鼠CD8分子的小鼠胸腺瘤細(xì)胞系BW5147-CD8與抗原特異的T細(xì)胞在PEG1500作用下融合，制備PPE26:44-52

11、特異性的CD8+T細(xì)胞雜交瘤。經(jīng)過(guò)HAT選擇性培養(yǎng)基篩選后對(duì)生長(zhǎng)出的細(xì)胞克隆進(jìn)行鑒定，共檢測(cè)136個(gè)細(xì)胞孔，僅有1E1、4A8和4D8三個(gè)克隆能夠特異識(shí)別多肽進(jìn)行抗原遞呈實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證1E1、4A8和4D8三個(gè)克隆均為PPE26:44-52特異性的，且MHC限制性都為H-2Kd，這與預(yù)測(cè)結(jié)果一致。獲得的雜交瘤細(xì)胞株將為定量測(cè)定APC上特定的MHC-肽復(fù)合物提供生物材料。
　　4.結(jié)核分枝桿菌PPE25、PPE26、PPE27和P

12、E19蛋白的原核表達(dá)及免疫生物學(xué)特性研究
　　以結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增ppe25，ppe26，ppe7和pe19基因，并將其克隆到表達(dá)載體中，重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE結(jié)果顯示目的蛋白獲得了成功表達(dá)，相對(duì)分子質(zhì)量分別為40 kD、44 kD、41 kD和15kD，目的蛋白主要以包涵體形式表達(dá)。對(duì)包涵體進(jìn)行變復(fù)性后進(jìn)行鎳柱親和純化，獲得了純度較高的

13、融合蛋白。Western blotting結(jié)果表明，重組蛋白均能與抗HIS單抗發(fā)生特異反應(yīng)，表現(xiàn)出良好的反應(yīng)原性。將純化的重組蛋白免疫新西蘭大白兔，能有效地刺激特異性抗體的產(chǎn)生，從而證明PPE25、PPE26、PPE27和PE19均具有較強(qiáng)的體液免疫原性，其中以PPE26誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體的能力最強(qiáng)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)，PPE25/27:56-71、PPE26:370-385和PE19:56-71是相關(guān)蛋白的優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞表位。結(jié)核病人的外周血單核細(xì)