結(jié)核分枝桿菌Esx-1分泌系統(tǒng)相關(guān)蛋白EspL、EspG1的生化性質(zhì)和功能的研究.pdf

1、由巨噬細(xì)胞等人體免疫細(xì)胞聚集形成的肉芽腫是結(jié)核病的形成標(biāo)志，肉芽腫的形成在結(jié)核分枝桿菌的致病過程中扮演著重要角色，它使被感染的宿主與結(jié)核分枝桿菌融合在一起。結(jié)核分枝桿菌通過特異性的蛋白分泌系統(tǒng)Esx-1分泌系統(tǒng)將具有毒性作用的毒力因子通過高疏水性的細(xì)胞膜分泌到胞外。這些毒力因子與宿主中肉芽腫的形成以及結(jié)核分枝桿菌毒性作用有關(guān)。EspL是結(jié)核分枝桿菌Esx-1分泌系統(tǒng)中的一個重要的蛋白，已有研究表明EspL可能通過影響另外兩個毒力因子Es

2、pE和ESAT-6的分泌而調(diào)控肉芽腫的形成。但是EspL的結(jié)構(gòu)與功能以及調(diào)控肉芽腫的形成分子機制尚未清楚。
　　結(jié)構(gòu)生物學(xué)是測定生物大分子空間結(jié)構(gòu)和分子間相互作用的強有力的技術(shù)手段。解析Esx-1分泌系統(tǒng)中重要蛋白的三維結(jié)構(gòu)，并闡明這些蛋白之間的相互作用及其機制，將有助于人們更好地理解Esx-1分泌系統(tǒng)發(fā)揮功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和分子機制，并為結(jié)核病的預(yù)防和診斷及抗結(jié)核病藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)。鑒于結(jié)核分枝桿菌EspL（MtEspL）蛋白

3、的結(jié)構(gòu)和功能尚不清楚。本論文著重研究MtEspL蛋白的表達純化和功能。我們摸索并優(yōu)化了大量MtEspL重組子表達純化條件，最終成功地制備出大量的、高純度的、構(gòu)象均一的、穩(wěn)定的MtEspL蛋白樣品。MtEspL在大腸桿菌的產(chǎn)率是14 mg/L，蛋白的純度為98％。然后，我們用多種生物物理技術(shù)對MtEspL蛋白進行了理化性質(zhì)表征。動態(tài)光散射實驗表明MtEspL以二聚體形式存在;遠(yuǎn)紫外CD光譜實驗表明MtEspL的二級結(jié)構(gòu)主要以α螺旋為主;脲

4、變性實驗表明MtEspL結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性相對較差;1H-15N HSQC實驗表明MtEspL在溶液中以對稱二聚體存在，結(jié)構(gòu)折疊良好，意味著有可能通過生物NMR技術(shù)解析MtEspL的三維結(jié)構(gòu);熒光實驗表明MtEspL與DNA有中等偏強的相互作用。我們的研究結(jié)果為下一步解析MtEspL的三維結(jié)構(gòu)和深入闡明MtEspL的功能奠定了基礎(chǔ)。
　　EspG1是結(jié)核分枝桿菌中Esx-1分泌系統(tǒng)中另外一個重要的蛋白(MtEspG1)，作為分子伴侶蛋白

5、，它能夠特異性地識別并結(jié)合Esx-1分泌系統(tǒng)中的PE/PPE蛋白，將PE/PPE蛋白引導(dǎo)到分泌通道，通過分泌通道分泌到細(xì)菌體外。這些PE/PPE蛋白被鑲嵌在細(xì)菌表面，或者分泌到被感染的宿主體內(nèi)，發(fā)揮毒性作用。因此，MtEspG1在結(jié)合分枝桿菌中具有重要的生理功能，缺失MtEspG1將減弱結(jié)核分枝桿菌的毒性。MtEspG1的低同源蛋白MtEspG5的三維結(jié)構(gòu)已被解析了，但是MtEspG1的三維結(jié)構(gòu)尚未報道，可能是緣于制備MtEspG1蛋白