結(jié)核分枝桿菌廣譜脅迫蛋白Rv2624c的功能研究.pdf

1、博士學位論文學校代碼：10023學號：B2011035007結(jié)核分枝桿菌廣譜脅迫蛋白Rv2624c的功能研究所院：姓名：指導教師：導師小組：學科專業(yè)：研究方向：完成日期：病原生物學研究所賈瓊王健偉研究員王健偉研究員朱國峰研究員病原生物學結(jié)核分枝桿菌廣譜脅迫蛋白2014年4月中國醫(yī)學科學院博士研究生學位論文中文摘要結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，Mtb)是導致結(jié)核病的病原菌。全球約有三分之一的人口感染結(jié)核

2、分枝桿菌，每年約有兩百萬人死于結(jié)核病，因此結(jié)核病成為嚴重威脅人類健康的疾病之一。據(jù)估計，人類感染結(jié)核分枝桿菌后，只有10％的感染能夠轉(zhuǎn)化為活動性肺結(jié)核；在其余90％的感染中，細菌在宿主肺部存留維持代謝休眠狀態(tài)而進入潛伏感染期。結(jié)核分枝桿菌的潛伏感染在結(jié)核病發(fā)病機理中起非常重要的作用，但是目前相關(guān)的調(diào)節(jié)機制尚不明確。近年來已有研究證明結(jié)核分枝桿菌的廣譜脅迫蛋I芻(UniversalStressProtein，usP)家族與潛伏感染有關(guān)，研

3、究這類家族蛋白的功能，以期為結(jié)核分枝桿菌的潛伏感染研究提供一些線索。廣譜脅迫蛋白是一種古老且保守的蛋白家族，當細菌處于環(huán)境壓力脅迫情況下，比如營養(yǎng)物質(zhì)缺乏，缺氧，NO脅迫，生長環(huán)境中有重金屬離子等毒性物質(zhì)存在，熱休克以及DNA損傷等，該家族蛋白參與表達調(diào)控，有助于維持細菌在壓力下存活。感染宿主的結(jié)核分枝桿菌被巨噬細胞吞噬后逐步形成肉芽腫，此時的結(jié)核分枝桿菌恰好就處于氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)缺乏的壓力環(huán)境中。結(jié)核分枝桿菌包含十個廣譜脅迫蛋白，研究表

4、明其中一個廣譜脅迫蛋白Rv2623是細菌進入慢性感染期必須的蛋白，該蛋白能夠調(diào)節(jié)結(jié)核分枝桿菌在體內(nèi)和體外的生長，并且這種調(diào)節(jié)與蛋白結(jié)合ATP的功能有關(guān)，提示該家族蛋白與結(jié)核分枝桿菌的潛伏感染形成具有密切關(guān)系。本論文主要針對結(jié)核分枝桿菌廣譜脅迫蛋白Rv2624c進行功能研究。首先構(gòu)建Rv2624c在大腸桿菌(Ecoli)中的重組表達質(zhì)粒，將該蛋白在大腸桿菌中進行表達純化，并且用純蛋白免疫新西蘭大白兔制作抗Rv2624c的兔多克隆抗體。通過

5、對Rv2624c純蛋白進行生化活性檢測，證實了Rv2624c具有ATP結(jié)合能力但體外單獨存在時不具有ATP酶活性。對該蛋白ATP結(jié)合保守區(qū)域的氨基酸進行點突變后，突變體的ATP結(jié)合能力下降，證明了突變的氨基酸在蛋白對ATP的結(jié)合中起關(guān)鍵性作用。其次對過表達Rv2624c野生型和突變體的恥垢分枝桿菌進行了繪制生長曲線實驗和斑點生長實驗，結(jié)果顯示過表達Rv2624c對恥垢分枝桿菌的體外生長沒有影響。同時，用過表達Rv2624c野生型和突變體

6、的恥垢分枝桿菌侵染巨噬細胞THPl后比較細菌存活率，我們發(fā)現(xiàn)Rv2624c過表達的恥垢分枝桿菌的存活率高于對照菌株，且突變體的存活率趨勢與ATP結(jié)合能力大小成正比。轉(zhuǎn)錄組測序分析表明，對差異表達的基因進行KEGGpathway顯著性富集分析，我們發(fā)現(xiàn)過表達Rv2624c的恥垢分枝桿菌和對照菌株相比差異最大的通路是精氨酸脯氨酸代謝通路以及色氨酸代謝通路。通過熒光實時定量PCR驗證Rv2624c過表達的恥垢分枝桿菌中這兩條通路的相關(guān)基因在轉(zhuǎn)