幽門螺桿菌CagM、CagI蛋白的生物信息學分析.pdf

1、幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，H.pylori）是目前發(fā)現(xiàn)唯一能夠在人胃內(nèi)定植、生存的微需氧革蘭氏陰性桿菌。是世界性分布的病原菌，也是目前人類發(fā)生率最高的慢性細菌感染之一，全世界范圍內(nèi)感染率超過50％。來自世界各地的流行病學研究證實，H.pylori感染是消化性潰瘍和慢性胃炎的重要病因，并與胃癌和胃黏膜相關(guān)淋巴樣組織(MALT)淋巴瘤的發(fā)病密切相關(guān)，1994年世界衛(wèi)生組織已將其列為Ⅱ類致癌原。cag致病島編碼的Ⅳ型

2、分泌系統(tǒng)是幽門螺桿菌的一個重要致病因素，通過此分泌系統(tǒng)cag致病島可將其唯一效應分子CagA轉(zhuǎn)運至宿主細胞并發(fā)揮其毒性作用。目前，cag致病島編碼基因的生物學功能及其參與H.pylori致病的機制尚未明確，因此，本文以cag致病島中的cagM、cagI基因為研究對象，通過分子生物學、微生物學及生物信息學等技術(shù)探討H.pylori cagM、cagI基因的結(jié)構(gòu)和功能，以指導以后的實驗研究，為更深入研究cag致病島的致病機理奠定理論基礎(chǔ)。<

3、br>　　方法:
　　1.根據(jù)GenBank中已報道的H.pylori22695的全基因組序列，利用生物信息學軟件Primer5.0自行設(shè)計cagM、cagI基因引物，獲得H.pylori cagM、cagI基因。
　　2.cagM、cagI基因T-A克隆后構(gòu)建pGEM-T-cagM，pMD18-T-cagI載體，并進行序列測定。
　　3.cagM、cagI基因測序結(jié)果提交GenBank，獲得基因庫登錄號。
　　

4、4.運用DNAstar V7.1軟件和ANTHEPROT5.0軟件分析CagM、CagI蛋白基本性質(zhì)，包括:氨基酸組成、分子量、等電點、疏水性、親水性、抗原性等。
　　5.利用生物信息學軟件分析H.pylori cagM、cagI基因核苷酸序列及蛋白序列同源性。
　　6.運用ANTHEPROT5.0軟件和網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫等分析預測其結(jié)構(gòu)，用PROSITESCAN和Fingerprint分析推測其潛在的功能，包括蛋白的跨膜區(qū)、信號肽

5、和剪切位點、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)、功能位點、亞細胞定位、蛋白家族、蛋白質(zhì)指紋圖譜等。
　　結(jié)果:
　　1.應用PCR技術(shù)成功克隆了H.pylori cagM、cagI基因。
　　2.cagM、cagI基因T-A克隆后測序，基因測序結(jié)果表明:H.pyloriNCTC11637cagM基因全長1149bp（GenBank基因庫登錄號為:GU269568），與設(shè)計序列大小完全一致，編碼376個氨基酸;H.pylori NCTC

6、11637cagI基因全長1086bp(GenBank基因庫登錄號為:HM126476)，與設(shè)計序列大小完全一致，編碼361個氨基酸。
　　3.CagM、CagI基本性質(zhì)分析:CagM蛋白有376個氨基酸，分子量為43.76kD，理論等電點為9.3，有多個疏水區(qū)域和親水區(qū)域，有多個抗原決定簇;CagI蛋白有361個氨基酸，分子量為39.37kD，理論等電點為5.56，疏水性不是很強，接近兩親性，親疏水區(qū)域間隔分布，有多個明顯的具有

7、抗原活性的結(jié)構(gòu)域。
　　4.H.pylori cagM、cagI基因核苷酸序列及蛋白序列同源性比對分析發(fā)現(xiàn):H.pylori cagM、cagI核苷酸序列與GenBank中已知的其他H.pylori菌株cagM、cagI的核苷酸序列同源性分別為96～99％和95～99％;將核苷酸序列按標準密碼子翻譯成蛋白質(zhì)后，其氨基酸序列與其他H.pylori菌株氨基酸序列同源性分別為98～99％和96～99％。
　　5.CagM、CagI

8、結(jié)構(gòu)預測分析: CagM蛋白N端20個氨基酸為信號肽，有一段跨膜區(qū)，剪切位點在第20個和第21個氨基酸之間，二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)中螺旋結(jié)構(gòu)為主體，CagM蛋白定位于細菌周質(zhì)空間;CagI蛋白N端20個氨基酸亦為信號肽，有三段跨膜區(qū)，剪切位點亦在第20個和第21個氨基酸之間，二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)中螺旋結(jié)構(gòu)亦為主體，CagI蛋白是定位于外膜。
　　6.CagM、CagI功能預測分析:CagM屬于蛋白水解酶家族，有多個磷酸化位點，是多種激酶

9、的底物，有糖基化位點和豆蔻化位點，通過翻譯后剪切修飾，形成有功能的蛋白，在細菌周質(zhì)空間行使信號傳遞和集裝Ⅳ型分泌系統(tǒng)中其他蛋白的功能;CagI為穩(wěn)定的疏水蛋白，保守性很強，有N-糖基化作用位點、蛋白激酶C磷酸化位點、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點和豆蔻?；饔梦稽c，有膜蛋白、菌毛蛋白、轉(zhuǎn)運蛋白、水解酶、ATP/GTP酶、微管蛋白、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子、錨蛋白、分泌系統(tǒng)蛋白等多個蛋白標簽。
　　結(jié)論:
　　1.成功克隆了H.pylori ca

10、g致病島中的cagM、cagI基因。
　　2.獲得了CagM、CagI蛋白的大部分理化特征數(shù)據(jù)，包括:氨基酸組成、分子量、等電點、疏水性、親水性、抗原性等。
　　3.H.pylori cagM、cagI核苷酸序列及蛋白序列同源性比對分析發(fā)現(xiàn)cagM、cagI基因作為H.pylori cag致病島編碼的Ⅳ型分泌系統(tǒng)結(jié)構(gòu)基因之一，其核苷酸序列及氨基酸序列相對保守，說明二者在幽門螺桿菌致病過程中具有重要作用。
　　4.應用生