幽門螺桿菌CagT及CagM蛋白的生物學(xué)性質(zhì)及功能研究.pdf

1、幽門螺桿菌是一種微需氧螺旋狀的人類病原菌,世界上約一半人口的胃部都有這種細(xì)菌定植。幽門螺桿菌的感染通常發(fā)生在兒童時(shí)期,若不使用相應(yīng)的抗生素治療則會(huì)伴隨至人終老而不能清除。這種細(xì)菌不僅能在人的胃內(nèi)定植多年,甚至在歷史的長河中與人類相伴了一個(gè)相當(dāng)長的時(shí)期?；蚍治霰砻?幽門螺桿菌在約58000年前隨著人類從東非遷往世界各地并與人類共同進(jìn)化,且越來越適應(yīng)人類的胃內(nèi)環(huán)境,給人類造成嚴(yán)重的胃部和十二指腸疾病,甚至胃癌?；诖?1994年世界衛(wèi)生組

2、織宣布幽門螺桿菌為Ⅰ類致癌因子。
　　 幽門螺桿菌中長約40 kb的DNA編碼的致病島-毒素相關(guān)基因致病島(cytotoxin-associated gene pathogenicity island,cag PAI)是一種Ⅳ型分泌系統(tǒng)(typeⅣ secretion system,T4SS),通常由28～30個(gè)基因組成。它通過將唯一的效應(yīng)分子CagA轉(zhuǎn)運(yùn)至胃上皮細(xì)胞,發(fā)生磷酸化,激活細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)信號(hào)通路,引起細(xì)胞的增殖、分化和

3、細(xì)胞延長,形成所謂的“蜂鳥”表型和介導(dǎo)IL-8的分泌來發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。
　　 基于cag PAI在幽門螺桿菌致病中的重要作用,國內(nèi)外學(xué)者針對cag PAI開展了一系列研究。CagT基因是cag PAI中的一個(gè)關(guān)鍵基因,在由cag PAI引起的宿主病理損傷中扮演一個(gè)重要角色。cagT基因敲除菌株能阻斷CagA分子轉(zhuǎn)運(yùn)至宿主細(xì)胞,進(jìn)而阻斷宿主細(xì)胞“蜂鳥”表型的形成和IL-8的分泌。CagT(HP0532)是cag PAI中的一個(gè)蛋白

4、,也是cag PAI的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),與CagY蛋白一起構(gòu)成了cag PAI的構(gòu)框架。CagM(HP0537)是cag PAI的一個(gè)重要功能蛋白,cagM基因敲除菌株能夠阻斷CagA轉(zhuǎn)運(yùn)至宿主細(xì)胞和宿主細(xì)胞的IL-8分泌。但目前關(guān)于cagT和cagM基因的研究還較少,它們在cag PAI致病中的作用機(jī)理研究尚在初始階段。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探討了CagT和CagM蛋白的生物學(xué)性質(zhì)以及在幽門螺桿菌引起宿主病理損傷和疾病中的作用。

5、r>　　 1.CagT、CaM及CagA蛋白的表達(dá)、純化及免疫學(xué)性質(zhì)研究提取26695菌株的基因組,采用PCR技術(shù)擴(kuò)增去掉信號(hào)肽的cagM和cagT基因,cagA基因的部分片段,并將擴(kuò)增的三個(gè)片段純化后采用T/A法克隆至pMD19-T載體。用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶切下目的片段,根據(jù)目的片段攜帶的酶切位點(diǎn),將cagM基因與pQE30載體連接,轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞E.coli M15；將cagT基因和caga基因片段分別與pET-28a(+)和pE

6、T-30a(+)載體連接,轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞E.coli BL21(DE3)。用1mmol/L IPTG誘導(dǎo)三個(gè)重組菌中的目的蛋白表達(dá),重組的CagM、CagT和CagA蛋白均可以可溶和包涵體兩種表達(dá)形式表達(dá)。包涵體洗滌液洗滌CagM和CagA包涵體重組蛋白。采用親和層析純化經(jīng)過洗滌的CagM和CagA包涵體蛋白和CagT可溶蛋白。純化后的三個(gè)蛋白各自免疫家兔制備各自的多克隆抗體。ELISA和Western blotting試驗(yàn)證明三個(gè)重組

7、蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性。
　　 2.幽門螺桿菌cagT,cagM與cagA基因缺失菌株的構(gòu)建與鑒定將含有氯霉素基因(Cam)的質(zhì)粒pHe12和pBluescript SK(-)自殺質(zhì)粒用SmaⅠ和XbaⅠ酶切后,Cam和pBluescript SK(-)連接。以26695菌株基因組為模板分別擴(kuò)增cagM,cagT與cagA基因的上下游片段,克隆至pMD19-T載體,三個(gè)基因的上游片段用SacⅡ+XbaⅠ酶切后插入含Cam基因的

8、pBluescript SK(-)質(zhì)粒,下游片段用ApaⅠ+SalⅠ酶切后插入含上游片段和Cam基因的pBluescript SK(-)質(zhì)粒,分別構(gòu)建cagM,cagT與cagA基因敲除菌株自殺質(zhì)粒。三個(gè)基因敲除自殺質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化入26695菌株感受態(tài)細(xì)胞,在含有25μg/ml氯霉素抗性的平板上篩選敲除菌株。最后用PCR和Western blotting鑒定相應(yīng)的敲除菌株。三個(gè)基因敲除菌株分別命名為△cagT、△cagM和△cagA。這些

9、基因敲除菌株的成功構(gòu)建為研究CagT和CagM如何在幽門螺桿菌cag PAI轉(zhuǎn)運(yùn)CagA蛋白進(jìn)入宿主細(xì)胞發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)提供了良好的研究工具。
　　 3.CagT和CaM蛋白對CagA轉(zhuǎn)運(yùn)和磷酸化的影響及宿主細(xì)胞分泌IL-8的影響搖瓶培養(yǎng)幽門螺桿菌26695菌株、11637菌株、△caga菌株、△cagM菌株和△cagT菌株,待菌液濃度達(dá)到OD為0.5-1.0時(shí),感染AGS細(xì)胞,感染復(fù)數(shù)為200,檢測不同菌株感染后AGS細(xì)胞的形態(tài)

10、變化、CagA蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)及磷酸化情況和IL-8的分泌。結(jié)果顯示,26695和11637野生株感染AGS細(xì)胞后,AGS細(xì)胞在形態(tài)上呈現(xiàn)“蜂鳥”表型,CagA蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至AGS細(xì)胞內(nèi)發(fā)生磷酸化,細(xì)胞培養(yǎng)上清中有大量IL-8分泌。△cagT菌株和△cagM菌株感染AGS細(xì)胞后,AGS細(xì)胞在形態(tài)沒有明顯變化,CagA蛋白也不能轉(zhuǎn)運(yùn)至AGS細(xì)胞,這與△cagA感染后的結(jié)果相同,細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-8分泌與陰性對照沒有顯著差異:與之相反,△cagA感染

11、細(xì)胞的IL-8分泌與野生株相近。由此證明,CagM和CagT蛋白均是cagPAIⅣ型分泌系統(tǒng)中對CagA轉(zhuǎn)運(yùn)至宿主細(xì)胞起關(guān)鍵作用的蛋白,且與宿主細(xì)胞IL-8的分泌密切相關(guān)。
　　 4.cagT和CagM蛋白的生物學(xué)性質(zhì)和部分生物學(xué)功能研究本部分主要研究了CagT和CagM蛋白的生物學(xué)性質(zhì)和部分生物學(xué)功能。首先檢測了CagT和CagM蛋白在攜帶完整cagPAI的幽門螺桿菌野生株中是否發(fā)生分子修飾和分子大小變化,幽門螺桿菌野生株破菌

12、后利用Western blotting檢測發(fā)現(xiàn),CagT和CagM蛋白在幽門螺桿菌野生株中不發(fā)生分子修飾。利用不同的去污劑溶解,超速離心分級分離細(xì)菌的菌體蛋白,鑒定CagT和CagM蛋白在細(xì)胞膜的定位,結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測,證明CagT和CagM蛋白均位于細(xì)菌細(xì)胞的內(nèi)膜和外膜部位。鑒于效應(yīng)蛋白CapA位于細(xì)胞內(nèi)膜,進(jìn)一步檢測了它與CagT和CagM蛋白之間的相互作用,免疫共沉淀試驗(yàn)的結(jié)果表明,CagA和CagT之間存在相互作用,而與Cag

13、M不存在相互作用。本試驗(yàn)還用免疫沉淀試驗(yàn)檢測CagT和CagM蛋白是否存在于胞外,Western blotting的結(jié)果表明,這兩個(gè)蛋白均不能分泌至胞外,它們功能的發(fā)揮只能依賴于錨定在細(xì)胞膜上。最后,Western blotting試驗(yàn)證明cagM基因敲除菌株不會(huì)影響CagT蛋白的表達(dá)。
　　 通過上述研究表明,CagT蛋白在幽門螺桿菌T4SS轉(zhuǎn)運(yùn)CagA進(jìn)入宿主細(xì)胞發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的過程中既作為構(gòu)成cagPAI不可或缺的一個(gè)結(jié)構(gòu)