高鹽誘導幽門螺桿菌生物學特性變化及其機制的研究.pdf

1、幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H.pylori)是一種富含多種菌體蛋白的致病菌,其感染了世界人口的一半以上并與多種胃疾病密切相關。目前僅在苛刻的環(huán)境,如人和靈長類動物的胃里發(fā)現H.pylori的存在。在胃或某些尚不清楚的傳播環(huán)境,H.pylori必須迅速耐受pH、氧化應激及宿主免疫損傷才能得以生存。因此,了解H.pylori能夠在眾多惡劣環(huán)境中生存的調節(jié)機制是十分重要的。目前為止,直接探討H.pylori與環(huán)境因素

2、方面的研究較少。僅流行病學研究提示,高鹽飲食作為環(huán)境因素與H.pylori有著密切關系,高鹽飲食與H.pylori感染對胃疾病的發(fā)展有正協同作用。但尚未有明確證據表明,H.pylori是否能夠耐受高鹽環(huán)境。
　　 以往細菌學研究顯示,細菌能夠改變自身的生物學性狀及基因表達以適應環(huán)境的變化,這種改變對其生存極其重要。大多數致病菌可以通過基因表達改變,尤其是毒力基因表達改變來抵抗環(huán)境變化對其造成的影響,如環(huán)境因素可以調控產毒性大腸桿

3、菌(ETEC)毒力因子、定植因子表達,高滲環(huán)境可以誘導S.typhimurium菌株侵襲基因invA的表達;霍亂弧菌毒素、纖毛和其他毒力因子在高滲環(huán)境中仍然保持活性。John T.Loh和Hanan Gancz兩位學者分別用含有不同鹽濃度的液體培養(yǎng)液誘導H.pylori26695,以探索高鹽環(huán)境對H.pylori及其毒力因子表達有何影響,結果John T.Loh發(fā)現鹽導致了細菌cagA轉錄水平及蛋白表達隨鹽濃度升高而增加,而Hanan

4、Gancz發(fā)現cagA轉錄水平未隨鹽濃度升高而增加,與John T.Loh結論不一致。H.pylori是否能夠在高鹽環(huán)境生存及其耐鹽機制如何?在高鹽環(huán)境下,H.pylori生物學特性有哪些改變及致病能力如何?均有待于進一步研究。
　　 本文通過H.pylori的耐鹽性及其機制、高鹽誘導培養(yǎng)后其生物學特性差異及其致病能力的研究,探索H.pylori的特殊生存環(huán)境及其調節(jié)機制,為進一步探討H.pylori傳播途徑及其臨床治療提供線索

5、。
　　 目的：
　　 探討H.pylori是否具有耐鹽性,其耐鹽機制如何;探討高鹽誘導培養(yǎng)后H.pylori生物學特性改變及其意義;探討高鹽誘導后H.pylori致病能力如何及其機制。
　　 方法：
　　 利用不同鹽濃度培養(yǎng)條件(對照組、3％、15％、30％)培養(yǎng)來源于人胃黏膜的H.pylori,利用相關基因檢測和HE、吉姆薩染色、W-S銀染技術對H.pylori進行形態(tài)學鑒定;利用微生物活力檢測試劑盒

6、檢測經鹽誘導培養(yǎng)后H.pylori活力情況;利用原子吸收分光光度計檢測細胞內Na+、K+的變化;利用碘結晶沉淀法檢測細胞內甜菜堿的變化。
　　 利用微生物活力檢測試劑盒檢測鹽誘導培養(yǎng)的H.pylori活力變化情況;利用普通顯微鏡、電子顯微鏡觀察細菌形態(tài)學變化;利用尿素酶實驗觀察鹽誘導培養(yǎng)的細菌酶學變化;利用Real-Time RT-PCR檢測鹽誘導培養(yǎng)的細菌ureB、cagA mRNA表達情況;利用western-blot技術檢

7、測鹽誘導培的細菌UreB、CagA蛋白表達情況;利用電鏡觀察細菌與細胞共培養(yǎng)后H.pyIori在細胞周圍的定植情況。
　　 采用細菌與細胞共培養(yǎng)技術,利用普通光學顯微鏡及電鏡觀察細菌作用后細胞的形態(tài)學損傷情況;利用免疫熒光檢測鹽誘導培養(yǎng)的細菌導致細胞DNA氧化損傷情況;利用流式細胞術檢測鹽誘導培養(yǎng)的細菌導致細胞線粒體膜電位改變情況;利用免疫組化技術檢測鹽誘導培養(yǎng)的細菌導致細胞增殖相關蛋白Ki-67、PCNA、P21表達情況。

8、r>　　 結果：
　　 1、高鹽培養(yǎng)基收集的細菌,提取其DNA,經16SrRNA、ureB、cagA基因擴增并測序,聯合細菌特異性染色鑒定證實其為H.pylori。
　　 2、高鹽誘導培養(yǎng)后細菌的形態(tài)發(fā)生了改變,由螺旋桿狀向雙膜“U”、鏈鎖型、球體形轉變。
　　 3、高鹽誘導培養(yǎng)后H.pylori仍然具有尿素酶活力;仍然具有ATP活力;與對照組比,高鹽誘導培養(yǎng)48h后細菌活力減低,30％鹽誘導組細菌活力強于3％

9、、15％鹽組;
　　 4、H.pylori耐鹽與細胞內K+、甜菜堿蓄積密切相關。
　　 5、不同鹽濃度誘導培養(yǎng)的H.pylori cagA mRNA及蛋白表達下降,但無濃度依賴性,15％鹽組下降幅度高于30％鹽組,差異有統(tǒng)計學意義;鹽誘導培養(yǎng)的H.pylori ureB mRNA轉錄水平30％鹽組高于15％鹽組,UreB蛋白表達下降,15％鹽組高于30％鹽組,但差異均無統(tǒng)計學意義。
　　 6、電鏡觀察高鹽誘導培養(yǎng)

10、的H.pylori仍可在細胞周圍定植。
　　 7、30％鹽誘導培養(yǎng)的H.pylori可以導致GES-1細胞形態(tài)學損傷;可以導致細胞DNA氧化損傷,8-OhDG表達增高,差異有統(tǒng)計學意義;可以導致線粒體膜的破壞,線粒體膜電位下降,但差異無統(tǒng)計學意義。
　　 8、30％鹽誘導培養(yǎng)的H.pylori可導致反映細胞增殖改變的生物標志Ki-67、PCNA表達增高,P21表達下降,且差異均有統(tǒng)計學意義。
　　 結論：