結(jié)核分枝桿菌免疫優(yōu)勢抗原蛋白PPE68的制備及血清學診斷的研究.pdf

1、結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的一種能在人類、家畜、家禽、野生動物(如鹿、羚羊、獾和各種野鳥)之間傳播的疾病。20世紀以來，由于人口劇增、耐藥性的產(chǎn)生、人類免疫缺陷病毒感染流行、免疫抑制劑的使用等原因，結(jié)核病日益嚴重，在全球范圍內(nèi)又死灰復燃，成為傳染病的首位殺手。目前，結(jié)核診斷的金標準仍是臨床檢查結(jié)合細菌培養(yǎng)和涂片直接鏡檢再輔以X線檢查。這些方法均依賴于病人的臨床癥狀，因而不可能發(fā)現(xiàn)亞臨床感染的早期病人。因此，結(jié)核病的快速、準確診斷，是全球

2、控制結(jié)核病的重要措施。 尋找到結(jié)核分支桿菌的特異性抗原，對于結(jié)核病的診斷具有重要意義．RD1區(qū)是卡介苗減毒傳代過程中最先缺失的一段區(qū)域，它與結(jié)核分枝桿菌毒力相關(guān)，因為該區(qū)基因所編碼的蛋白能被宿主免疫系統(tǒng)高度識別，目前大家對結(jié)核分枝桿菌診斷試劑的研究主要集中在RD1區(qū)，RD1區(qū)一共編碼9個蛋白，PPE68是由位于該區(qū)的Rv3873所編碼的蛋白。研究表明PPE68能夠被淋巴細胞所識別，激發(fā)出強烈的細胞免疫，刺激小鼠脾淋巴細胞增殖，誘

3、導大量IIFN-γ產(chǎn)生，可以認為PPE68是除ESAT-6和CFP-10以外的第3種重要的免疫優(yōu)勢抗原。 本研究利用PCR技術(shù)從結(jié)核桿菌H37Rv國際標準株中擴增Rv3873基因，并將其定向克隆pGEX-4T-1中，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pGRv3873并轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導表達后Western blot鑒定，鑒定成功后采用谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶融合蛋白純化試劑盒對rPPE68進行純化，

4、SDS-PAGE鑒定純化的rPPE68，然后將rPPE68免疫新西蘭大白兔，制備rPPE68多克隆抗體，建立起以PPD、rPPE68為包被抗原檢測結(jié)核病人血清中特異性抗體的間接ELISA檢測方法，為了能進一步區(qū)分病人是否為現(xiàn)癥感染，本實驗建立了兔抗rPPE68多克隆抗體作為包被抗體檢測結(jié)核病人血清中特異性抗原的雙抗體夾心ELISA檢測方法，為結(jié)核病的早確診、早治療提供了一種新的技術(shù)思路。在另一方面，本研究將Rv3873基因定向克隆至真核

5、表達載體pcDNA3.1(+)中，構(gòu)建成Rv3873基因真核表達載體，為進一步研究新型結(jié)核桿菌DNA疫苗奠定了基礎．在另一方面，本研究將Rv3873基因定向克隆至真核表達載體pcDNA3.1(+)中，構(gòu)建成Rv3873基因真核表達載體，為進一步研究新型結(jié)核桿菌DNA疫苗奠定了基礎。本研究共分五部分進行： 1．通過設計結(jié)核分枝桿菌Rv3873特異性引物，用PCR方法從結(jié)核分枝桿菌H37Rv國際標準株中擴增出目的基因Rv3873,

6、克隆入高效原核表達載體pGEX-4T-1中，成功構(gòu)建原核重組質(zhì)粒pGRv3873。 2．原核重組質(zhì)粒pGRv3873，經(jīng)IPTG誘導，成功表達出約63kDa的rPPE68融合蛋白，并對蛋白進行了包涵體溶解，使其變?yōu)榭扇苄缘鞍住?3．純化rPPE68融合蛋白，用它免疫新西蘭大白兔，成功制備到特異性、高效價的兔抗rPPE68多克隆抗體。 4．以結(jié)核菌素純化蛋白衍生物(PPD)為包被抗原，通過對血清稀釋度、封閉液、底物

7、作用時間及陰陽判定方法等方面的摸索，建立了優(yōu)化后的PPD-ELISA程序，參考此方法，建立了以結(jié)核分枝桿菌特異性蛋白rPPE68為包被抗原檢測結(jié)核病人血清中特異性抗體的間接ELISA檢測方法．分別檢測到PPD、rPPE68的靈敏度為57％、30％，特異性為73.6％、92.7％，分析后認為，rPPE68與PPD比較，在結(jié)核病的診斷上顯示了更高的特異性，但是靈敏度卻欠佳。本部分研究還建立了以包被多克隆抗體檢測結(jié)核特異性抗原的雙抗體夾心EL

8、ISA方法，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，抗rPPE68的靈敏度較低，只有13％，特異性卻很高，達到93.6％，認為以結(jié)核特異性抗體來檢測病人血清中的結(jié)核特異性抗原的ELISA檢測方法是一種診斷是否為結(jié)核現(xiàn)癥感染的可行的新技術(shù)方法。 5．將pGRv3873中目的基因Rv3873亞克隆入pcDNA3.1(+)真核表達載體，成功構(gòu)建真核重組質(zhì)粒pcRv3873，為進一步研究該基因的免疫原性和免疫保護性奠定了基礎。 綜上所述，本研究選擇結(jié)核分枝