結核分枝桿菌免疫優(yōu)勢抗原蛋白PPE68的制備及血清學診斷的研究.pdf

1、結核病是由結核分枝桿菌引起的一種能在人類、家畜、家禽、野生動物(如鹿、羚羊、獾和各種野鳥)之間傳播的疾病。20世紀以來，由于人口劇增、耐藥性的產生、人類免疫缺陷病毒感染流行、免疫抑制劑的使用等原因，結核病日益嚴重，在全球范圍內又死灰復燃，成為傳染病的首位殺手。目前，結核診斷的金標準仍是臨床檢查結合細菌培養(yǎng)和涂片直接鏡檢再輔以X線檢查。這些方法均依賴于病人的臨床癥狀，因而不可能發(fā)現(xiàn)亞臨床感染的早期病人。因此，結核病的快速、準確診斷，是全球

2、控制結核病的重要措施。 尋找到結核分支桿菌的特異性抗原，對于結核病的診斷具有重要意義．RD1區(qū)是卡介苗減毒傳代過程中最先缺失的一段區(qū)域，它與結核分枝桿菌毒力相關，因為該區(qū)基因所編碼的蛋白能被宿主免疫系統(tǒng)高度識別，目前大家對結核分枝桿菌診斷試劑的研究主要集中在RD1區(qū)，RD1區(qū)一共編碼9個蛋白，PPE68是由位于該區(qū)的Rv3873所編碼的蛋白。研究表明PPE68能夠被淋巴細胞所識別，激發(fā)出強烈的細胞免疫，刺激小鼠脾淋巴細胞增殖，誘

3、導大量IIFN-γ產生，可以認為PPE68是除ESAT-6和CFP-10以外的第3種重要的免疫優(yōu)勢抗原。 本研究利用PCR技術從結核桿菌H37Rv國際標準株中擴增Rv3873基因，并將其定向克隆pGEX-4T-1中，構建重組表達質粒pGRv3873并轉化大腸桿菌JM109，用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導表達后Western blot鑒定，鑒定成功后采用谷胱苷肽-S-轉移酶融合蛋白純化試劑盒對rPPE68進行純化，

4、SDS-PAGE鑒定純化的rPPE68，然后將rPPE68免疫新西蘭大白兔，制備rPPE68多克隆抗體，建立起以PPD、rPPE68為包被抗原檢測結核病人血清中特異性抗體的間接ELISA檢測方法，為了能進一步區(qū)分病人是否為現(xiàn)癥感染，本實驗建立了兔抗rPPE68多克隆抗體作為包被抗體檢測結核病人血清中特異性抗原的雙抗體夾心ELISA檢測方法，為結核病的早確診、早治療提供了一種新的技術思路。在另一方面，本研究將Rv3873基因定向克隆至真核

5、表達載體pcDNA3.1(+)中，構建成Rv3873基因真核表達載體，為進一步研究新型結核桿菌DNA疫苗奠定了基礎．在另一方面，本研究將Rv3873基因定向克隆至真核表達載體pcDNA3.1(+)中，構建成Rv3873基因真核表達載體，為進一步研究新型結核桿菌DNA疫苗奠定了基礎。本研究共分五部分進行： 1．通過設計結核分枝桿菌Rv3873特異性引物，用PCR方法從結核分枝桿菌H37Rv國際標準株中擴增出目的基因Rv3873,

6、克隆入高效原核表達載體pGEX-4T-1中，成功構建原核重組質粒pGRv3873。 2．原核重組質粒pGRv3873，經IPTG誘導，成功表達出約63kDa的rPPE68融合蛋白，并對蛋白進行了包涵體溶解，使其變?yōu)榭扇苄缘鞍住?3．純化rPPE68融合蛋白，用它免疫新西蘭大白兔，成功制備到特異性、高效價的兔抗rPPE68多克隆抗體。 4．以結核菌素純化蛋白衍生物(PPD)為包被抗原，通過對血清稀釋度、封閉液、底物

7、作用時間及陰陽判定方法等方面的摸索，建立了優(yōu)化后的PPD-ELISA程序，參考此方法，建立了以結核分枝桿菌特異性蛋白rPPE68為包被抗原檢測結核病人血清中特異性抗體的間接ELISA檢測方法．分別檢測到PPD、rPPE68的靈敏度為57％、30％，特異性為73.6％、92.7％，分析后認為，rPPE68與PPD比較，在結核病的診斷上顯示了更高的特異性，但是靈敏度卻欠佳。本部分研究還建立了以包被多克隆抗體檢測結核特異性抗原的雙抗體夾心EL

8、ISA方法，經檢測發(fā)現(xiàn)，抗rPPE68的靈敏度較低，只有13％，特異性卻很高，達到93.6％，認為以結核特異性抗體來檢測病人血清中的結核特異性抗原的ELISA檢測方法是一種診斷是否為結核現(xiàn)癥感染的可行的新技術方法。 5．將pGRv3873中目的基因Rv3873亞克隆入pcDNA3.1(+)真核表達載體，成功構建真核重組質粒pcRv3873，為進一步研究該基因的免疫原性和免疫保護性奠定了基礎。 綜上所述，本研究選擇結核分枝