中國(guó)河南地區(qū)人群染色體CLPTM1L和AGPHD1基因區(qū)域遺傳變異與肺癌易感性的相關(guān)研究.pdf

1、1.目的
　　肺癌是肺部最常見的惡性腫瘤。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的調(diào)查報(bào)告，許多國(guó)家和地區(qū)肺癌的發(fā)病率均占惡性腫瘤的首位。且男性多于女性，男女之比約為4-8∶1。近十年來中國(guó)肺癌發(fā)病率持續(xù)增高，環(huán)境因素被認(rèn)為是影響肺癌發(fā)病最重要的因素，主要包括吸煙、大氣污染等。如吸煙者肺癌發(fā)病率是不吸煙者的10-40倍。然而，吸煙者90％不會(huì)發(fā)展成肺癌，吸煙者不同家族和地域中發(fā)生肺癌的幾率也并不相同，提示個(gè)體的遺傳因素在肺癌的發(fā)生和發(fā)展中也起著重要的作

2、用。越來越多的研究表明肺癌是環(huán)境與個(gè)體基因相互作用引起的，致癌物代謝、DNA修復(fù)和細(xì)胞增殖與凋亡控制基因的遺傳變異等，都可能是與吸煙有關(guān)的肺癌的重要遺傳易感因素。近年來，全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)提示人類基因組上某些單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)與肺癌易感性存在非常密切的關(guān)系，如染色體5p15.33位置CLPTM1L基因內(nèi)含子區(qū)域的rs401681和15q25上AGPHD1基因內(nèi)含子區(qū)域的rs8034191等。然而，由于人群種族、環(huán)境的

3、不同，中國(guó)與西方國(guó)家基因組中SNP位點(diǎn)存在很大的差異。已有文獻(xiàn)報(bào)道西方人群與肺癌相關(guān)的SNP位點(diǎn)在中國(guó)人群中不一定適用，因此在后GWAS時(shí)期，在中國(guó)人群中對(duì)這些易感位點(diǎn)進(jìn)行重復(fù)研究和驗(yàn)證就顯得非常重要。本研究主要采用高分辨率溶解曲線（high-resolutionmeltinganalysis，HRMA）這一高效、敏感與快速的方法在中國(guó)河南地區(qū)肺癌患者中檢測(cè)某些特定SNP位點(diǎn)與肺癌發(fā)生的相關(guān)性，旨在確定這些在歐洲人群中發(fā)現(xiàn)的肺癌易感性位

4、點(diǎn)是否也與中國(guó)人群肺癌發(fā)生密切相關(guān)。
　　2.資料與方法
　　2.1肺癌患者與樣本采集
　　收集2008年1月至2011年5月鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院手術(shù)切除的肺癌組織（含癌旁組織）石蠟標(biāo)本492例，其中病理診斷為非小細(xì)胞肺癌393例、小細(xì)胞肺癌99例。組織標(biāo)本中男性380例，女性112例，年齡22～79歲。同時(shí)采用河南省人民醫(yī)院體檢的無癥狀人群提取上肢外周血486例作為健康對(duì)照。
　　2.2基因組DNA提取

5、　　石蠟組織塊中癌旁組織基因組DNA的提取主要使用美國(guó)Qiagen公司的AllprepDNA/RNAFFPE試劑盒(Qiagen，Gaithersburg,MA，USA)，嚴(yán)格按照使用手冊(cè)操作。正常人外周血使用廣東Innogent公司的基因組DNA抽提試劑盒(InnogentgenomicDNAextractionkit)提取，嚴(yán)格按照使用手冊(cè)操作。
　　2.3高分辨率溶解曲線分析法（非標(biāo)記探針法）
　　2.3.1使用非標(biāo)記

6、探針法的不對(duì)稱PCR反應(yīng)體系
　　使用Primer3軟件(http://frodo.wi.mit.edu/primer3)設(shè)計(jì)rs8034191擴(kuò)增引物Foward:5'-AGCTACAGCGTCATCAAAGTG-3',Reverse:5'-TTCCCCTGATTTCCACAAG-3'（產(chǎn)物片段長(zhǎng)度131bp）;設(shè)計(jì)針對(duì)rs8034191野生型序列的探針（長(zhǎng)度25bp）:5'-AAGTTTTCTGTTTAGAAAGGCCCTG-

7、3'(C3-blocked)。rs401681的擴(kuò)增引物forward:5'-AGAAAACAAGGTCTGCTATCCA-3';reverse:5'-GACTCTTGATAAACTTACCAGCC-3'.C3封閉的非標(biāo)記探針的序列為:5'-ACAACTTCAGAGTCTATCATGGTGTGAAG-3'。以組織基因組DNA為模板，反應(yīng)總體積20μl，其中FermantasTaq(5U/μl)0.2μl，10×PCRBuffer(Mg2

8、+Plus)2μl，dNTPMixture(10mM)0.4μl，前向引物（1∶20稀釋）、反向引物各1μl，探針1μl，LC-Green熒光染料0.6μl。不對(duì)稱PCR條件:預(yù)變性95℃10min，55個(gè)循環(huán)擴(kuò)增（95℃10秒，56℃15秒，72℃25秒）。在不對(duì)稱PCR體系中，由于添加了過量的反向引物，故PCR反應(yīng)在耗盡前向引物擴(kuò)增長(zhǎng)度131bp的擴(kuò)增子后，在僅存反向引物的情況下形成較多的正義鏈（單鏈）。
　　2.3.2HRM

9、分析
　　分析條件為95℃2min，40℃2min，65℃～85℃梯度以0.02s/STEP升溫觀察熔解曲線變化。由于與rs8034191或rs401681野生型探針序列吻合，在不對(duì)稱PCR反應(yīng)中形成的正義鏈（單鏈）能與探針雜交形成探針結(jié)合鏈。因此，反應(yīng)體系中存在兩種不同的產(chǎn)物，即131bp的擴(kuò)增子與25bp的探針結(jié)合鏈。在HRM分析中，分別形成兩種熔解峰:主峰與探針峰。由于探針結(jié)合鏈在探針設(shè)計(jì)時(shí)即設(shè)定為Tm值小于擴(kuò)增子Tm值，所

10、以在升溫熔解過程中探針結(jié)合鏈?zhǔn)紫冉怄?，形成探針峰。如果?biāo)本為野生型，則與探針完全匹配，形成的探針單峰具有較高的Tm;如果標(biāo)本為純合突變型，則與探針不匹配，其Tm值小于野生型Tm值，形成的探針單峰具有較低的Tm，位于野生型探針峰的左側(cè);如果標(biāo)本為雜合突變，則在野生型與突變型位置都存在探針峰，為雙峰，且峰型據(jù)標(biāo)本所含突變比例的變化而變化。因此通過分析標(biāo)本熔解曲線的變化，可以檢測(cè)標(biāo)本是否存在突變。
　　2.4PCR產(chǎn)物測(cè)序
　　使

11、用上述正向及反向引物對(duì)30例肺癌及正常人基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將擴(kuò)增產(chǎn)物直接送檢測(cè)序（上海生物工程公司）
　　2.5組織總RNA提取及實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)
　　使用總RNA提取試劑盒在石蠟樣本中提取肺癌組織總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后，使用實(shí)時(shí)定量PCR法分別檢測(cè)CLPTM1L和AGPHD1基因的表達(dá)水平，觀察rs401681和rs8034191不同基因型對(duì)其所在基因表達(dá)的影響。
　　2.6數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　

12、　采用SPSS16.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。所有肺癌與正常樣本符合Hardy-Weinberg平衡，SNP位點(diǎn)次要等位基因頻率（minorallelefrequency，MIF）在患者于對(duì)照之間的比較使用卡方檢驗(yàn)或Fisher檢驗(yàn)。相關(guān)性的強(qiáng)弱使用優(yōu)勢(shì)比(oddsratio)OR和95％可信區(qū)間表示。不同基因型組之間基因表達(dá)的比較使用Graphpad軟件分析，使用的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法是非參數(shù)T檢驗(yàn)法。P＜0.05表示差異有顯著性意義。
　　

13、3.結(jié)果
　　共對(duì)492例肺癌組織標(biāo)本和486例健康配對(duì)標(biāo)本的基因組DNA中染色體5p15.33區(qū)域的SNP位點(diǎn)rs401681和15q25.1區(qū)域SNP位點(diǎn)rs8034191的多態(tài)性進(jìn)行了檢測(cè)和分析。肺癌患者和健康人群相比，rs401681位點(diǎn)等位基因頻率有顯著性差異(p＜0.05)，而rs8034191SNP位點(diǎn)基因型以及等位基因型分布頻率無顯著性差異。在病理分型分組比較中，處于TERT-CLPTM1L基因的rs401681位

14、點(diǎn)等位基因C/T的頻率與非小細(xì)胞肺癌密切相關(guān)(p=0.012，OR=1.29，95％可信區(qū)間=1.09-1.50)，但與小細(xì)胞肺癌沒有明顯的相關(guān)性(p=0.571，OR=1.15，95％可信區(qū)間=0.82-1.47)。在小細(xì)胞肺癌患者中rs8034191SNP位點(diǎn)基因型頻率及等位基因型頻率與非小細(xì)胞肺癌患者人群和正常對(duì)照人群均有顯著性差異(p=0.024)。此外，在rs8034191等位基因含突變型C（CC或CT型）的患者組織中AGPH

15、D1基因的表達(dá)較TT型的患者低。而在不同rs401681基因型的患者組織中CLPTM1L的表達(dá)沒有明顯差異。
　　4.結(jié)論
　　在中國(guó)人群中，CLPTM1L基因上的SNP位點(diǎn)rs401681的遺傳變異與肺癌——特別是非小細(xì)胞肺癌——的發(fā)病有密切的相關(guān)性。此外，AGPHD1基因區(qū)域SNP位點(diǎn)rs8034191的多態(tài)性與肺癌的易感性無關(guān)，但是亞組分析發(fā)現(xiàn)與小細(xì)胞肺癌的易感性相關(guān)。rs8034191等位基因含C(CT或CC)的肺癌