NFκB1和IκBα基因遺傳變異與慢性阻塞性肺疾病和肺癌易感性研究.pdf

1、研究背景：
　　慢性阻塞性肺疾病（Chronicobstructivepulmonarydisease，COPD）和肺癌（Lungcancer，LC）是呼吸系統(tǒng)常見的兩種疾病。最新數(shù)據(jù)顯示我國40歲以上人群COPD的患病率已達8.2％，在我國部分地區(qū)已位居居民死因第四位。肺癌是最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率均居于癌癥首位。最新的世界衛(wèi)生組織報告顯示我國肺癌男女發(fā)病率均位于世界前列，且女性發(fā)病率（21.3/10萬）明顯高于歐美等

2、發(fā)達國家。近幾十年來，隨著我國工業(yè)化、城市化進程加快所帶來的各種環(huán)境污染問題的加劇，COPD與肺癌的發(fā)病率與死亡率也急劇上升，已成為當前威脅我國居民生存健康的主要疾病之一。
　　COPD與肺癌關(guān)系密切，既往大量流行病學研究表明兩者具有共同的環(huán)境暴露，如吸煙、大氣污染、生物燃料使用、肺部感染等。其中，吸煙是兩者最主要的共同環(huán)境病因，研究表明60%以上COPD和90%肺癌的發(fā)病都與吸煙相關(guān)，但僅有20-30%的吸煙者會患COPD，10

3、-15%的吸煙者會患肺癌，提示個體易感因素在兩者的發(fā)病過程中起著決定性的作用。近年來，遺傳易感因素與COPD和肺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)被廣泛報道，多個人群關(guān)聯(lián)研究尤其是全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）報道了多個疾病易感位點。我們通過比對肺癌、肺功能和COPD的全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS），發(fā)現(xiàn)兩者的易感基因在人染色體上定位基本是重疊的。COPD與肺癌的病因譜和易感基因的存在廣泛重疊，表明COPD與肺癌可能存在共同的發(fā)病機制。
　　炎癥反應被

4、認為是COPD和肺癌的共同發(fā)病機制。煙草等環(huán)境毒物能夠刺激肺部的炎癥反應，引起炎癥相關(guān)分子如核轉(zhuǎn)錄因子-kappaB(NucleartranscriptionfactorkappaB，NFκB)等的異常激活，導致免疫反應異常等一系列機體反應，最終促進COPD或肺癌的發(fā)病。同時，COPD還可使肺部長期處于炎癥狀態(tài)和誘發(fā)肺基質(zhì)重構(gòu)，促進肺部癌前病變的發(fā)生，增加肺癌的發(fā)病危險。NFκB是機體細胞內(nèi)調(diào)控炎癥反應的核心分子，其內(nèi)源性抑制物-核轉(zhuǎn)錄

5、因子kappaB抑制蛋白（InhibitorofnucleartranscriptionfactorkappaB，NFKBI，又稱IκB）可抑制其活性，NFκB與IκB的平衡是機體調(diào)控炎癥最有效的手段。研究發(fā)現(xiàn)COPD和肺癌的發(fā)病過程中皆存在NFκB異?；罨透弑磉_現(xiàn)象，且在重度吸煙者，COPD患者和肺癌患者中NFκB的表達水平同樣明顯高于正常人。提示NFκB的異?；罨赡苁荂OPD和肺癌發(fā)病的共同機制。
　　NFκB家族有五個成

6、員，包括：p105/p50，p52/p100，p65/RelA，c-Rel和RelB。在哺乳動物中，p105/p50和p52/p100這兩種蛋白分別由NFκB1和NFκB2基因編碼，最主要的二聚體是p50和p65/RelA亞單位。在靜息細胞中，NFκB可被其抑制蛋白（IκB蛋白家族）隔絕而失活，在IκB蛋白家族中最普遍存在的是IκBα。前期關(guān)聯(lián)研究報道了多個位于NFκB1、NFκB2和IκBα基因的單核苷酸多態(tài)性(SingleNucle

7、otidePolymorphism，SNP)[例如NFκB1基因(-94del>insATTG)，IκBα基因(-826C>T，2758G>A)等]可影響其基因的功能，從而與多種疾病發(fā)病相關(guān)，包括炎癥性疾?。ㄈ鐗乃佬孕∧c結(jié)腸炎、酒精性肝硬化等）、自身免疫性疾病（如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化病、白塞氏病等）和惡性腫瘤（如肝癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌等）。NFκB/IκB與COPD和肺癌發(fā)病密切相關(guān)，上述遺傳變異極有可能改變基因的功能，影響肺部

8、的炎癥狀態(tài)，從而影響COPD和肺癌的發(fā)生發(fā)展，因此，本課題擬通過廣州和蘇州兩個人群的研究探討NFκB/IκB基因的遺傳變異與COPD和肺癌發(fā)病的關(guān)聯(lián)，并通過功能實驗闡述其影響疾病發(fā)生的分子機制。
　　科學假說：
　　環(huán)境因素可通過激活NFκB信號通路，從而調(diào)節(jié)細胞凋亡、炎癥反應和腫瘤發(fā)生。NFκB1、NFκB2和IκBα是人類NFκB信號通路最常見的核心分子，前期研究已報道NFκB1、NFκB2和IκBα基因上的功能性多態(tài)與

9、多個疾病發(fā)病相關(guān)，因此我們提出NFκB1、NFκB2和IκBα三個基因的遺傳變異可能會改變其基因功能，從而影響人群COPD和肺癌發(fā)病風險性的研究假說。
　　研究目的：
　　探討NFκB/IκB基因4個潛在功能性SNP[NFκB1基因(-94del>insATTG)，NFκB2基因(-2966G>A)和IκBα基因(-826C>T，2758G>A)]與COPD和肺癌發(fā)病的關(guān)聯(lián)；分析基因-基因以及基因-環(huán)境交互作用對COPD和肺

10、癌發(fā)病中的影響，揭示上述遺傳變異的生物學實質(zhì)，以探索COPD和肺癌的共同易感機制，為COPD和肺癌的預防、診斷、治療提供科學依據(jù)。
　　研究方法：
　　本研究采用雙中心病例-對照研究，在廣州和蘇州這兩個地區(qū)開展，分別在廣州人群和蘇州人群中收集病例和對照。其中，廣州人群中收集的研究對象包括1025例COPD病例，1056例肺癌病例和1061例健康正常對照；蘇州人群中收集的研究對象包括486例COPD病例，503肺癌病例和616

11、健康正常對照。調(diào)查員先經(jīng)培訓合格后參與調(diào)查，通過詢問研究對象，記錄人口學基本特征和環(huán)境變量，包括吸煙、飲酒、既往史、家族史、職業(yè)史等。調(diào)查后填寫調(diào)查表，并在調(diào)查表上簽名。經(jīng)簽署知情同意書后，病例和對照皆采集外周靜脈血5ml，并提取DNA進行后續(xù)分子流行病學檢測。另外，2002年至2010年期間在廣州地區(qū)3個社區(qū)開展了長期的COPD隨訪，每年對這些研究對象進行肺功能檢測，已收集116例COPD患者和357例健康人的肺功能4年隨訪資料。

12、r>　　在以往的研究中，對NFκB1、NFκB2和IκBα基因的遺傳變異與人群疾病發(fā)病的關(guān)聯(lián)進行了探討。其中，NFκB1基因-94del>insATTG(rs28362491)，NFκB2基因-2966G>A(rs12769316)，IκBα基因-826C>T(rs2233406)和2758G>A(rs696)四個位點的單核苷酸多態(tài)性被報道與多個疾病發(fā)病相關(guān)，并且-94del>insATTG，2758G>A這兩個位點已被證實為功能性位點

13、。因此，本研究我們擬從上述4個遺傳變異位點出發(fā)，分析NFκB1、NFκB2和IκBα基因的遺傳變異與COPD和肺癌易感性的關(guān)聯(lián)，闡述COPD和肺癌的共同發(fā)病機制。
　　運用Taqman法檢測兩個地區(qū)的病例和對照四個多態(tài)性位點的基因型。由于-94del>insATTG變異的生物學功能已經(jīng)被證實，我們重點分析2758G>A多態(tài)性的生物學功能。采用Real-timePCR方法檢測肺癌組織和癌旁組織中IκBα的mRNA水平，采用Weste

14、rnblotting方法檢測肺癌組織和癌旁組織中IκBα的蛋白質(zhì)水平，采用免疫組織化學法檢測IκBα在肺癌組織中的原位表達水平。
　　通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，IκBα基因2758G>A變異可能會影響miR-449a和miR-34b與IκBα基因3’非翻譯區(qū)3’-UTR結(jié)合的能力，所以我們利用體外實驗熒光素酶基因報告系統(tǒng)，分析在未經(jīng)任何microRNA干擾下IκBα基因的表達，采用real-timePCR方法檢測在有效microRN

15、A干擾下，A549(2758GG基因型)和NCI-520(2758AG基因型)細胞系中IκBα基因的表達。
　　運用卡方檢驗和t檢驗分析病例組和對照組在性別、年齡、吸煙、飲酒、既往史等人口學特征的差異。運用單因素非條件logistic回歸模型，分析每個單核苷酸多態(tài)性位點與疾病發(fā)生的危險性關(guān)聯(lián)，采用相乘交互作用模型分析環(huán)境-基因交互作用的可能性。在分層分析中，采用Breslow-Day檢驗各層樣本的同質(zhì)性。利用PS軟件計算統(tǒng)計效能。

16、分別運用單因素方差分析、Student’st檢驗和線性回歸模型，分析不同NFκB1基因型人群的肺功能值、每年的第一秒用力呼氣容積（Forcedexpiratoryvolumein1second，F(xiàn)EV1）下降值的差異，不同IκBα基因型的IκBαmRNA水平和蛋白表達的差異。采用Student’st檢驗分析含不同等位基因的質(zhì)粒中的luciferase報告基因表達水平的差異。應用SAS9.13軟件進行分析，所有的檢驗均為雙側(cè)檢驗，檢驗水準

17、為α=0.05，P<0.05被認為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：
　　在對照組中，NFκB1基因-94del>insATTG(rs28362491)；NFκB2基因-2966G>A(rs12769316)；IκBα基因-826C>T(rs2233406)和IκBα基因2758G>A(rs696)四個位點基因型頻率均符合Hardy-Weinberg平衡，說明對照組符合隨機人群分布的標準。
　　在廣州人群中，多態(tài)性位點-9

18、4del>insATTG與COPD發(fā)病有關(guān)聯(lián)(P<0.05)，多態(tài)性位點2758G>A與肺癌發(fā)病有關(guān)聯(lián)(P<0.05)。以攜帶del/del基因型的個體為參照，-94ins變異基因型(ins/ins+ins/del)的攜帶者發(fā)生COPD的危險性是del/del基因型攜帶者的1.23倍(OR=1.23；95%CI=1.03-1.54；P=0.037)。但在肺癌組中沒有發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象。與2758GA+GG基因型攜帶者相比，2758AA基因型攜

19、帶者罹患肺癌的危險性是2758GA+GG基因型攜帶者的1.61倍(OR=1.61；95%CI=1.31-1.96；P=0.000)。此外，我們既未發(fā)現(xiàn)-2966G>A和-826C>T這兩個多態(tài)性位點與COPD發(fā)病風險的關(guān)聯(lián)，也未發(fā)現(xiàn)這兩個多態(tài)性位點與肺癌發(fā)病風險的關(guān)聯(lián)。
　　在蘇州人群中，我們進一步驗證了上述陽性關(guān)聯(lián)位點，得出的結(jié)果與廣州人群中的結(jié)果一致。在蘇州人群中，多態(tài)性位點-94del>insATTG與COPD發(fā)病風險有關(guān)聯(lián)

20、(P<0.05)，多態(tài)性位點2758G>A和肺癌發(fā)病風險有關(guān)聯(lián)(P<0.05)。以攜帶del/del基因型者為參照，攜帶-94ins變異基因型(ins/ins+ins/del)者COPD發(fā)病風險是攜帶del/del基因型者的1.33倍(OR=1.33；95%CI=1.04-1.81；P=0.047)，而-94ins基因型與肺癌發(fā)病風險無關(guān)聯(lián)(OR=1.13；95%CI=0.84-1.53；P=0.417)。以攜帶2758GG/AG基因型

21、者為參照，2758AA基因型攜帶者罹患肺癌的危險性是2758GG/AG基因型攜帶者的1.69倍(OR=1.69；95%CI=1.27-2.25；P=0.003)，但未發(fā)現(xiàn)其與COPD的發(fā)病風險有關(guān)聯(lián)。
　　經(jīng)同質(zhì)性檢驗，我們發(fā)現(xiàn)廣州人群和蘇州人群研究結(jié)果具有同質(zhì)性(Breslow-Daytest，NFκB1基因-94del>insATTG：P=0.734；IκBα基因2758G>A：P=0.941)，我們合并了廣州人群和蘇州人群數(shù)

22、據(jù)以提高統(tǒng)計效能，結(jié)果顯示攜帶-94ins變異基因型(ins/ins+ins/del)的個體罹患COPD危險性是攜帶del/del基因型個體的1.27倍(OR=1.27；95%CI=1.06-1.52；P=0.009)。而攜帶2758AA基因型個體患肺癌風險是攜帶其他基因型個體的1.63倍(OR=1.63，95%CI=1.39-1.92；P=0.000)。
　　COPD是肺癌發(fā)病的危險因素，攜帶危險基因型的COPD病例發(fā)生肺癌的危

23、險性可能會更高。因此，我們進一步分析發(fā)現(xiàn)在前期罹患COPD且攜帶2758AA或-94ins危險基因型的人發(fā)生肺癌的風險皆顯著增加(2758AA：OR=1.68，95%CI=1.23-2.28; P=0.001;-94insATTG：OR=1.50，95%CI=1.01-2.21;P=0.043但在前期未催患COPD的患者中，-94ins變異基因型對肺癌發(fā)生的風險性影響不明顯。聯(lián)合這兩個基因型分析發(fā)現(xiàn)，以前期未催患COPD的個體為參照，攜

24、帶一個或兩個危險基因型的前期催患COPD的患者催患肺癌的危險性更高，OR值更高，特別是在攜帶兩種危險基因型的COPD患者中，肺癌發(fā)病風險更高(OR=2.52,95%CI=1.52-4.18;P=0.000)。
　　我們分析NFκB1基因型對肺功能的影響時，發(fā)現(xiàn)攜帶-94ins ATTG變異基因型的COPD患者，使用支氣管擴張劑前的FEV1值明顯低于攜帶-94de1/del ATTG基因型的COPD患者(方差分析P=0.004;t檢

25、驗P=0.002)。在對照組中，與攜帶其他基因型者相比，攜帶-94ins ATTG基因型者的吸入支氣管擴張劑后的FEV1占預計值百分比較低(t檢驗P=0.021)。但是，無論是COPD病例組，還是對照組，均未發(fā)現(xiàn)IκBα基因的兩個多態(tài)性位點基因型與肺功能值之間的關(guān)聯(lián)。
　　通過線性回歸分析發(fā)現(xiàn)，-94ins/del ATTG多態(tài)性位點基因型與吸入支氣管擴張劑前的FEV1值每年下降趨勢有關(guān)(-94ins/ins ATTG：n= 62

26、，-0.126±0.113L，-94ins/delATTG：n= 42，-0.091±0.083L，-94de1/del ATTG：n=12，-0.040±0.036L，方差分析P=0.015，線性回歸分析P=0.017)。進一步分析發(fā)現(xiàn)，-94de1>ins ATTG多態(tài)性與COPD病情進展有關(guān)聯(lián)，與COPD嚴重程度Gold分級有關(guān)聯(lián)(p=0.048)。但未發(fā)現(xiàn)IκBα基因單核苷酸多態(tài)性與肺功能值變化之間的關(guān)聯(lián)。
　　我們發(fā)現(xiàn)，

27、肺癌組織IκBα基因的mRNA表達水平明顯低于癌旁組織(t檢驗P=0.032)，提示IκBα可能起到抑制腫瘤的作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，攜帶2758AA基因型的患者IκBα的mRNA水平在肺癌組織(方差分析P=0.001，線性回歸分析P=0.008)和癌旁組織(方差分析P=0.002，線性回歸分析P=0.004)中攜帶2758GG或AG基因型的患者。IκBα蛋白表達檢測進一步確證了上述結(jié)果。另外，免疫組織化學法檢測發(fā)現(xiàn)，攜帶2758AA基因

28、型患者肺癌組織中原位IκBα的表達明顯低于攜帶2758GG或AG基因型患者(方差分析P=0.045)。
　　運用熒光素酶(Luciferase)報告基因分析法檢測含IκBα基因3'-UTR中2758A或2758G質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄活性，發(fā)現(xiàn)含2758A報告基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄活性明顯低于含2758G的報告基因((P值分別是0.022，0.036);加入miR-449a模擬物能夠進一步減少含2758A報告基因的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄活性(P=0.046，P

29、< 0.001)，而加入miR-449a抑制劑能夠上調(diào)報告基因的轉(zhuǎn)錄活性(P=0.003 P < 0.001)。然而，miR-34b模擬物對含2758A或2758G的報告基因轉(zhuǎn)錄活性均沒有明顯影響，提示2758A可能是miR-449a結(jié)合位點。
　　創(chuàng)新之處：
　　本研究發(fā)現(xiàn)，NFκB1啟動子區(qū)-94de1>ins ATTG變異可引起機體肺功能下降速度加快，增加COPD的發(fā)病風險;IκBα基因3'-UTR的2758G>A變異