miRNAs成熟體的遺傳變異與肺癌易感性的關(guān)聯(lián)研究.pdf

1、研究背景：
　　肺癌是危害人類生命健康最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率在全球大部分國家和地區(qū)均位居各類癌癥之首。由于缺乏有效的早期診斷方法以及有效的治療手段，肺癌的預(yù)后較差，其5年存活率不到20％。肺癌的科學(xué)防治已成為全球共同關(guān)注的熱點(diǎn)和公共衛(wèi)生問題。隨著國家工業(yè)化進(jìn)程、環(huán)境污染的不斷加劇，我國人群肺癌的發(fā)病率和死亡率迅速增長，已超過世界的平均水平，且目前仍呈不斷上升的趨勢，嚴(yán)重威脅我國居民的生命健康。研究顯示，吸煙是導(dǎo)致肺

2、癌的最主要環(huán)境因素，80%肺癌的發(fā)生與吸煙有著重要的聯(lián)系，但只有10%~15%吸煙者會(huì)得肺癌，且部分不吸煙者同樣會(huì)因得肺癌而死亡，提示肺癌可能與個(gè)體遺傳有關(guān)，遺傳因素在肺癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。愈來愈多的證據(jù)顯示，肺癌是一個(gè)多因素影響的復(fù)雜疾病，其發(fā)生是環(huán)境與遺傳因素相互作用的結(jié)果。
　　微小RNA（microRNA,miRNA）是近年來發(fā)現(xiàn)的一類保守的、非編碼小分子RNA,長度約22~24nt，通過與靶基因mRNA3’-非翻

3、譯區(qū)(3’-untranslated region,3’-UTR)的堿基互補(bǔ)配對(duì)，引起mRNA的降解或者翻譯抑制，從而調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)水平。研究表明，miRNAs參與了細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及腫瘤發(fā)生、侵襲等多種生理病理過程，尤其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著“癌基因”或者“抑癌基因”的類似角色。2002年研究者首次發(fā)現(xiàn)miRNAs有抑制腫瘤發(fā)生的作用，在大約68%的B細(xì)胞慢性淋巴白血病中，miR-15和miR-16存在缺失或下調(diào)；miR-1

4、5和miR-16可以負(fù)調(diào)控B細(xì)胞淋巴瘤2基因(B cell lymphoma2，BCL-2)，而BCL-2是一種抗凋亡癌基因并在多種腫瘤中過表達(dá)，因此推測miR-15和miR-16起著抑癌基因的作用。Takamizawa等人首次發(fā)現(xiàn)在肺癌組織中miRNAs的表達(dá)異常。通過檢測143個(gè)手術(shù)切除的肺癌組織標(biāo)本中miRNAs的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miRNA let-7的表達(dá)降低與患者術(shù)后生存時(shí)間密切相關(guān)；體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)把let-7導(dǎo)入肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549

5、后可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長。Hayashita等人研究發(fā)現(xiàn)miR-17-92簇，包括hsa-miR-17-5p,hsa-miR-17-3p，hsa-miR-18a，has-miR-19a，hsa-miR-19b-1，hsa-miR-20a和hsa-miR-92，在肺癌中有顯著的過表達(dá)，尤其是在小細(xì)胞肺癌組織中；把miR-17-92轉(zhuǎn)染入A549細(xì)胞，能促進(jìn)細(xì)胞增殖，而將其成員如miR-18a、miR-19a、miR-20a單獨(dú)轉(zhuǎn)染入A54

6、9中并不能促進(jìn)細(xì)胞增殖，提示miR-17-92家族作為一個(gè)整體而發(fā)揮作用。Cho等通過miRNA微陣列分析發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-126、hsa-miR-145、hsa-miR-21、hsa-miR-182、hsa-miR-183和hsa-miR-210在肺癌及正常組織中表達(dá)差異顯著。最新一項(xiàng)研究顯示，miR-193b在非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中表達(dá)下調(diào)，在A549細(xì)胞中導(dǎo)入miR-

7、193b可以抑制其生長、遷移和侵襲能力，且能抑制細(xì)胞周期蛋白D1和尿激酶型纖溶酶的活化。Markou等人發(fā)現(xiàn)，對(duì)于NSCLC病人的生存期，has-miR-21的過表達(dá)可作為一個(gè)獨(dú)立的負(fù)性預(yù)后標(biāo)志物。越來越多的證據(jù)顯示了miRNAs的表達(dá)變化與各種腫瘤的關(guān)聯(lián)。miRNAs家族已經(jīng)被公認(rèn)為基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵成員，影響著信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中下游基因，尤其是腫瘤相關(guān)基因的功能。因此，通過對(duì)miRNAs在不同腫瘤的序列分析、特定表達(dá)水平、以及探討

8、腫瘤相關(guān)靶基因等有利于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)miRNAs在疾病中的生物學(xué)作用。
　　單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)是人類基因組最常見的遺傳變異。大量的流行病學(xué)研究顯示SNP改變可以影響腫瘤（包括肺癌）形成、侵襲、轉(zhuǎn)移以及預(yù)后等過程。鑒于miRNA在基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中扮演的重要角色，位于miRNA基因序列的遺傳變異是否會(huì)影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展，也逐漸受到研究者的關(guān)注。已有文獻(xiàn)報(bào)道，位于miRNA成

9、熟體區(qū)域的遺傳變異影響其自身加工成熟過程，亦可改變與相關(guān)靶基因的互補(bǔ)配對(duì)能力，從而導(dǎo)致不同的生物學(xué)效應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)，位于miR-125a成熟體的一個(gè)SNP(G>T)能阻礙pri-miR125a到pre-miR125a的轉(zhuǎn)變，從而使成熟miR-125a表達(dá)下調(diào)；體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)該SNP削弱了miR-125a與靶基因lin-28的結(jié)合能力，使其對(duì)lin-28的翻譯抑制功能受限；而lin-28蛋白的過度積累可能會(huì)促進(jìn)肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和侵襲。近年來越

10、來越多的報(bào)道顯示，miRNAs基因序列的遺傳變異與肺癌的發(fā)病、治療和預(yù)后等亦有密切的關(guān)系。miRNAs，作為一類新型的基因調(diào)節(jié)小分子，有望為闡明肺癌發(fā)病的具體生物學(xué)機(jī)制提供一條新的途徑。
　　因此，我們經(jīng)生物信息學(xué)分析，基于miRBase（18.0版本，截止至1/1/2012）和HapMap(HapMap Data Rel28 PhaseII+III,Auegest10,on NCBI B36 assembly,dbSNP b12

11、6,截止至1/1/2012)公共數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站，針對(duì)已報(bào)道的人類所有miRNAs，篩選出位于miRNA成熟體區(qū)域且在中國人群常見的SNPs位點(diǎn)（低發(fā)等位基因頻率>0.05,minor allele frequency,MAF），并通過兩中心大樣本的病例對(duì)照研究，探討miRNAs成熟體區(qū)域的遺傳變異與肺癌易感性之間的關(guān)聯(lián)，為肺癌預(yù)防、生物學(xué)標(biāo)志物的篩選提供科學(xué)依據(jù)。
　　研究目的：
　　分析位于miRNA成熟體區(qū)域且是在中國人群中

12、常見的遺傳變異位點(diǎn)與人群肺癌發(fā)病的關(guān)聯(lián)，探討基因及基因-環(huán)境交互作用在肺癌發(fā)病中的作用，為肺癌高危人群或易感個(gè)體的篩選及肺癌的早期診斷和預(yù)防提供理論依據(jù)。
　　研究方法：
　　運(yùn)用生物信息學(xué)系統(tǒng)分析，篩選出位于miRNA成熟體區(qū)域且是在中國人群中常見的多態(tài)位點(diǎn)；并通過廣州-蘇州兩中心的病例-對(duì)照研究探討這些多態(tài)位點(diǎn)與肺癌發(fā)病的關(guān)聯(lián)。其中，廣州地區(qū)人群作為發(fā)現(xiàn)關(guān)聯(lián)的人群，包括1056例肺癌病例和1056例健康正常對(duì)照，蘇州地區(qū)

13、人群作為驗(yàn)證關(guān)聯(lián)的人群，包括503例肺癌病例和623例健康對(duì)照。采用TaqMan技術(shù)檢測所選取的多態(tài)位點(diǎn)的基因型，用SAS9.13統(tǒng)計(jì)軟件分析人群的人口學(xué)特征、篩選出危險(xiǎn)因素；采用非條件多因素Logistic回歸模型，分析基因變異與肺癌發(fā)病的關(guān)聯(lián)及“基因-環(huán)境”的交互作用。
　　研究結(jié)果：
　　1.1研究對(duì)象的人口學(xué)特征及單因素分析
　　廣州地區(qū)1056例肺癌中，按病理類型分類，包括384例腺癌（36.4%），369例

14、鱗癌（34.9%），43例大細(xì)胞肺癌（4.1%），128例小細(xì)胞肺癌（12.1%），132例為其他類型（如腺鱗癌、混合型肺癌，占12.5%）；按病理分期I~IV期的比例分別為14.5%（154例）、9.0%（94例）、31.5%（333例）及45.0%（475例）。蘇州地區(qū)503例肺癌患者中，包括231例腺癌（45.9%），158例鱗癌（31.4%）,23例大細(xì)胞癌（4.6%），65例小細(xì)胞癌（12.9%），26例其他類型肺癌（5.2%

15、）；按病例分期，I期46例（9.2%），II期53例（10.5%），III期157例（31.2%），IV期247例（49.1%）。單因素分析顯示，年齡、性別、肺癌家族史在廣州、蘇州地區(qū)人群病例和對(duì)照組的分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均>0.05）；而飲酒、吸煙、年吸煙量在兩中心人群的病例與對(duì)照組中則差異顯著（廣州人群：P值分別為0.042、0.028和0.000；蘇州人群：P值分別為0.017、0.000和0.011），說明以上因素是肺癌發(fā)病

16、的危險(xiǎn)因素。
　　1.2 miRNAs成熟體區(qū)域的多態(tài)位點(diǎn)的生物信息學(xué)分析
　　miRNA公共數(shù)據(jù)庫miRBase（http://mirbase.org，截止至1/1/2012）發(fā)布的人類miRNA序列信息，共1424個(gè)。經(jīng)過生物信息學(xué)系統(tǒng)分析，位于miRNA成熟體區(qū)域的多態(tài)位點(diǎn)共有205個(gè)，其中在中國人群中常見(MAF>0.05)位點(diǎn)有5個(gè)，包括
　　hsa-mir-499(rs3746444T>C)、hsa-mir

17、-608(rs4919510C>G)、
　　hsa-mir-3152(rs13299349G>A)、hsa-mir-4513(rs2168518G>A)、
　　hsa-mir-4520a(rs8078913T>C)。
　　1.3 miRNAs成熟體SNP與肺癌發(fā)病的關(guān)聯(lián)分析
　　在廣州人群對(duì)照組中，我們選取的5個(gè)單核甘酸多態(tài)位點(diǎn)的基因型頻率均符合哈迪-溫伯格平衡（Hardy-Weinberg Equilibriu

18、m，HWE）（P值均>0.05）。在廣州地區(qū)人群中，我們發(fā)現(xiàn)miR-499 rs3746444T>C多態(tài)與肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。以攜帶TT野生基因型的個(gè)體為參照，攜帶變異基因型（CT+CC）的個(gè)體發(fā)生肺癌的風(fēng)險(xiǎn)增加34%(校正OR=1.34;95%CI=1.11-1.62)；且rs3746444C等位基因變異數(shù)目與肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)具有顯著的劑量-反應(yīng)關(guān)系（Ptrend=0.000）。上述關(guān)聯(lián)在蘇州地區(qū)人群驗(yàn)證中也得到一致的結(jié)果，攜帶rs3746

19、444（CT+CC）變異基因型的個(gè)體發(fā)生肺癌的風(fēng)險(xiǎn)是攜帶TT野生基因型的1.38倍（校正OR=1.38;95%CI=1.07-1.80）。同質(zhì)性檢驗(yàn)顯示兩中心人群基因型分布一致（Breslow-Day檢驗(yàn)，P=0.704），因此合并人群分析以增大檢驗(yàn)效能。以rs3746444TT野生基因型個(gè)體為參照，CT雜合基因型的攜帶者患肺癌的風(fēng)險(xiǎn)是TT基因型攜帶者的1.19倍(校正OR=1.19；95%CI=1.01-1.40)，而CC基因型的攜帶

20、者則增加1.75倍(校正OR=2.75；95%CI=1.92-3.92)；將變異C基因型(CT+CC)合并做二分類處理，rs3746444C變異基因型(CT+CC)的個(gè)體罹患肺癌危險(xiǎn)性增加37%(校正OR=1.35；95%CI=1.16-1.57)。然而對(duì)于其他多態(tài)位點(diǎn)，未發(fā)現(xiàn)其基因頻率和等位基因頻率在病例和對(duì)照存在顯著性差異（P均>0.05），提示這些位點(diǎn)可能與人群肺癌易感性無關(guān)聯(lián)。
　　1.4分層分析
　　進(jìn)一步分層分析

21、發(fā)現(xiàn)，與攜帶 rs3746444TT基因型比較，攜帶 C變異基因型(CT+CC)的個(gè)體發(fā)生肺癌的危險(xiǎn)性在無肺癌家族史、無腫瘤家族史的人群中更為顯著（分別對(duì)應(yīng)OR=1.36，95%CI=1.16-1.58；OR=1.35,95%CI=1.15-1.58），但同質(zhì)性檢驗(yàn)顯示該位點(diǎn)變異基因型的危險(xiǎn)遺傳效應(yīng)在各亞組間并無顯著差異（P值分別為0.860和0.899）。
　　本研究創(chuàng)新之處
　　既往研究已報(bào)道部分miRNAs的遺傳變異與