MAPK-線粒體凋亡途徑在綿羊肺炎支原體致支氣管上皮細胞氧化損傷中的作用機制研究.pdf

1、背景:
　　綿羊肺炎支原體(Mycoplasma.ovipneumoniae，簡稱MO)是一種可感染綿羊和山羊，引起羊支原體肺炎的病原菌。綿羊肺炎支原體的主要宿主細胞是綿羊支氣管上皮細胞，其在感染宿主細胞的過程中會造成宿主細胞損傷;近年來研究發(fā)現(xiàn)，綿羊肺炎支原體可以通過自身代謝掠奪養(yǎng)分產(chǎn)生H2O2，導致活性氧(ROS)的積累。線粒體作為細胞呼吸作用的重要細胞器，對ROS較為敏感，ROS的沉積會造成線粒體的損傷，線粒體損傷又可以進一

2、步導致細胞凋亡;并且，ROS還是絲裂素活化蛋白激酶(MAPK)信號途徑的激活劑，MAPK信號途徑的主要作用是將信號從細胞外傳至細胞內的各種細胞器。然而，綿羊肺炎支原體產(chǎn)生的ROS是否能誘導宿主細胞發(fā)生氧化應激反應，以及其是否經(jīng)MAPK和/或線粒體凋亡途徑造成宿主細胞損傷尚不可知。
　　方法與內容:
　　本研究采用綿羊支氣管上皮細胞的氣液相界面培養(yǎng)(Air-Liquid Interface，ALI)模型，通過DCFH-DA及J

3、C-1探針裝載、WST-8、Western Blot、AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡流式細胞術檢測、Tunel原位末端凋亡檢測等方法開展了以下研究:1.通過檢測綿羊肺炎支原體感染支氣管上皮細胞后產(chǎn)生ROS、丙二醛(MDA)、GSH/GSSG的水平，抗氧化物酶活性以及線粒體膜電位變化，以探討該病原菌是否誘導宿主細胞發(fā)生氧化應激反應;2.在綿羊肺炎支原體感染宿主細胞后不同時間，移除培養(yǎng)體系中的病原體，繼續(xù)培養(yǎng)不同時間，檢測細胞中的RO

4、S含量，以探討導致宿主細胞發(fā)生氧化應激的ROS的效應模式;3.用綿羊肺炎支原體感染經(jīng)ROS清除劑NAC和線粒體靶向抗氧化劑MiTo-TEMPO處理和未處理的宿主細胞，檢測細胞中ROS、線粒體膜電位、細胞凋亡以及MAPK和線粒體信號途徑中相關蛋白表達量的變化，以探討該病原菌誘導產(chǎn)生的ROS是否經(jīng)MAPK/線粒體凋亡途徑誘導宿主細胞凋亡;4.用綿羊肺炎支原體感染經(jīng)ERK抑制劑(PD032590)、JNK抑制劑(SP600125)和P38 M

5、APK抑制劑(SB203580)處理和未處理的宿主細胞，檢測細胞中ROS、線粒體膜電位、細胞凋亡以及線粒體信號途徑中相關蛋白表達量的變化，以探討該病原菌經(jīng)MAPK途徑誘導宿主細胞線粒體損傷的機制。
　　結果:
　　1.綿羊肺炎支原體感染支氣管上皮細胞產(chǎn)生ROS，引發(fā)氧化應激反應，導致線粒體的損傷，進而誘導細胞凋亡。這一過程伴隨著細胞內MDA、GSSG水平的增加和抗氧化蛋白酶CAT、GSS、T-SOD、Mn-SOD表達水平及G

6、SH活性水平的降低。
　　2.綿羊肺炎支原體感染支氣管上皮細胞不同時間后，清除培養(yǎng)體系中的病原體后繼續(xù)培養(yǎng)，細胞中的ROS含量在較長時間保持較高水平。提示，綿羊肺炎支原體的一過性感染對支氣管上皮細胞發(fā)生的氧化應激反應具有明顯的觸發(fā)效應。
　　3.綿羊肺炎支原體感染產(chǎn)生的ROS激活細胞中ERK、JNK和p38 MAPK信號介導的MAPK信號途徑，抑制BCL-2抗凋亡蛋白的表達，進而導致線粒體損傷并釋放細胞色素C(Cyt-C)進

7、入細胞質，啟動caspases信號級聯(lián)反應，最終誘導宿主細胞發(fā)生凋亡。
　　4.綿羊肺炎支原體感染經(jīng)線粒體靶向抗氧化劑MiTo-TEMPO預處理的支氣管上皮細胞后，宿主細胞中ERK、JNK和P38MAPK信號介導的MAPK信號途徑中的MEK、ERK、p90RSK、JNK1/2、AP-1、TAK1、MKK3/6和P38 MAPK等關鍵蛋白的磷酸化水平顯著降低(P＜0.05、P＜0.01)，表明綿羊肺炎支原體誘導支氣管上皮細胞產(chǎn)生的R

8、OS對ERK、JNK和P38MAPK信號介導的MAPK信號途徑具有正反饋作用。
　　結論:
　　本研究利用綿羊支氣管上皮細胞ALI界面培養(yǎng)模型探討了綿羊肺炎支原體感染支氣管上皮細胞過程中誘導宿主細胞凋亡的潛在作用機理。研究結果表明，綿羊肺炎支原體感染誘導宿主細胞產(chǎn)生的ROS通過增加支氣管上皮細胞的脂類過氧化物、降低細胞抗氧化物的水平等途徑誘發(fā)宿主細胞的氧化應激反應，激活宿主細胞的MAPK信號途徑，改變BCL-2家族蛋白水平的