DKK1抑制巨噬細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積及其相關(guān)分子機制.pdf

1、本文主要從以下幾個方面展開論述：
　　第一部分 Ox-LDL調(diào)節(jié)巨噬細胞DKK1的表達及相關(guān)分子機制
　　研究背景：
　　動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)的發(fā)病率與日俱增，易損斑塊發(fā)生的破裂和繼發(fā)的血栓形成，是誘發(fā)急性冠脈綜合征、心肌梗死和中風(fēng)等多種疾病的主要機制之一。傳統(tǒng)觀點認為，動脈粥樣硬化始于血管壁內(nèi)皮損傷，單核細胞募集并遷入內(nèi)膜下轉(zhuǎn)變?yōu)榫奘杉毎?，識別并吞噬脂質(zhì)形成泡沫細胞，同時募集白細胞、平

2、滑肌細胞等進入斑塊，積聚脂質(zhì)、中央核心壞死，導(dǎo)致斑塊破裂的發(fā)生。
　　氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)是動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的重要因素。研究發(fā)現(xiàn)，ox-LDL可以損傷內(nèi)皮，誘導(dǎo)單核細胞趨化，促進平滑肌增殖遷移，加速泡沫細胞形成，引起炎癥反應(yīng)，加劇脂質(zhì)沉積等動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展過程。
　　研究目的:
　　(1)明確ox-LDL對巨噬細胞中DKK1的調(diào)節(jié)作用;
　　(2)明確LXRs在ox-LDL調(diào)節(jié)DKK1

3、中的作用;
　　(3)明確β-catenin與LXRs的相互作用在ox-LDL調(diào)節(jié)DKK1中的作用。
　　研究方法:
　　1.細胞培養(yǎng)
　　購自ATCC的人單核/巨噬細胞系以RPMI-1640（含10％胎牛血清、1％青霉素/鏈霉素）懸浮培養(yǎng)。并以終濃度為160nM的PMA誘導(dǎo)貼壁為巨噬細胞，作為實驗的模型細胞。
　　2.細胞轉(zhuǎn)染
　　β-catenin、LXRα和LXRβ的siRNA和陰性對照Nega

4、tive control siRNA均由上海吉瑪公司合成，按照脂質(zhì)體Lipo-2000的說明書進行轉(zhuǎn)染后，給予不同的刺激并檢測。
　　3.蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)
　　提取不同刺激后細胞的蛋白，99℃加熱10分鐘，SDS-PAGE電泳，按照對應(yīng)的分子量切膠，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗孵育4℃過夜，洗膜后二抗孵育1小時20分鐘，洗去附著的二抗，化學(xué)發(fā)光，分析對應(yīng)的蛋白條帶的灰度值。
　　4.實時熒光定量PCR

5、分析
　　刺激結(jié)束后利用Trizol法提取細胞中的總核糖核酸(Ribonucleic Acid，RNA)，測定提取的RNA濃度，使用TaKaRa公司的cDNA合成試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成互補脫氧核糖核酸（Complementary Deoxyribonucleic Acid，cDNA），再使用TaKaRa公司的SYBR Green實時定量PCR試劑盒進行PCR反應(yīng)，以測定DKK1和內(nèi)參蛋白的mRNA表達情況。
　　研究結(jié)果：

6、
　　1.ox-LDL上調(diào)巨噬細胞DKK1的表達
　　2.經(jīng)典Wnt通路參與ox-LDL對巨噬細胞中DKK1表達的調(diào)節(jié)
　　3.LXRα參與ox-LDL對巨噬細胞中DKK1表達的調(diào)節(jié)，而LXRβ不參與
　　4.ox-LDL下調(diào)巨噬細胞中LXRs與β-catenin的相互作用
　　結(jié)論：
　　(1) ox-LDL能夠上調(diào)巨噬細胞中DKK1的表達;
　　(2) ox-LDL能夠減少LXRα對β-ca

7、tenin的抑制作用來上調(diào)DKK1的表達。
　　第二部分 DKK1抑制巨噬細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積及相關(guān)脂質(zhì)受體的變化
　　研究背景：
　　DKK1與脂肪代謝存在著密不可分的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，DKK1能夠促進脂肪生成的過程，同時發(fā)現(xiàn)可源于脂肪細胞分布異常的成人肥胖，其脂肪生成過程異常主要由于經(jīng)典Wnt通路的異?；罨偷退降腄KK1所致。在動脈粥樣硬化過程中DKK1與巨噬細胞的脂質(zhì)代謝功能是否存在著一定的聯(lián)系未見報道。
　　

8、巨噬細胞吞噬脂質(zhì)變?yōu)榕菽毎趧用}粥樣硬化中起到了重要的作用。巨噬細胞的脂質(zhì)代謝主要分為脂質(zhì)的吞噬、轉(zhuǎn)化和排出三個過程來維持其穩(wěn)態(tài)和平衡。巨噬細胞通過胞膜受體識別攝取脂蛋白和脂蛋白顆粒，并運送到溶酶體后被分解為氨基酸及游離膽固醇。繼而酯酰輔酶A膽固醇脂酰轉(zhuǎn)移酶(ACAT)將其轉(zhuǎn)化為膽固醇酯儲存在胞質(zhì)中。當(dāng)膽固醇接收體如HDL、apoA-Ⅰ等存在時，胞內(nèi)的游離膽固醇可經(jīng)過胞膜上的受體ABCA1、ABCG1等外流，減少胞質(zhì)內(nèi)脂質(zhì)過度沉積。<

9、br>　　在動脈粥樣硬化過程中DKK1與巨噬細胞的脂質(zhì)代謝功能是否存在著一定的聯(lián)系未見報道。
　　研究目的：
　　(1)明確DKK1對巨噬細胞脂質(zhì)代謝的作用;
　　(2)明確經(jīng)典Wnt通路在DKK1調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝中發(fā)揮的作用;
　　(3)明確巨噬細胞中DKK1對脂質(zhì)受體LOX-1和ABCA/G1的調(diào)節(jié)及相關(guān)信號通路。
　　研究方法：
　　1.細胞培養(yǎng)
　　本實驗使用的THP-1細胞系為單核/巨噬細

10、胞系，購自美國ATCC中心。將PMA加入培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)細胞貼壁生長，成為THP-1來源的巨噬細胞。
　　2.細胞轉(zhuǎn)染
　　DKK1、β-catenin和STAT3的siRNA和陰性對照Negative contro1 siRNA均由上海吉瑪公司合成，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染，具體步驟參照Lipo-2000的說明書進行。
　　3.蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)
　　刺激結(jié)束后RIPA裂解液提取蛋白，加入5×蛋白上

11、樣緩沖液，煮沸，SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗孵育4℃過夜，洗去附著的一抗，對應(yīng)的二抗室溫孵育，洗去附著的二抗，化學(xué)發(fā)光法檢測相應(yīng)的蛋白灰度值。
　　4.細胞油紅O染色
　　刺激結(jié)束后，4％甲醛固定細胞，使用配制的油紅O工作液染色10分鐘，洗去浮色，蘇木素染核2分鐘，鹽酸酒精分化15秒，置于清水中返藍7分鐘，甘油明膠封片短期保存，并拍照統(tǒng)計脂質(zhì)沉積情況。
　　研究結(jié)果：
　　1.DKK1抑制巨噬細胞

12、內(nèi)脂質(zhì)沉積
　　2.Wnt通路參與DKK1對巨噬細胞脂質(zhì)沉積的抑制作用
　　3.DKK1通過抑制經(jīng)典Wnt通路下調(diào)巨噬細胞脂質(zhì)受體LOX-1的表達
　　4.DKK1通過活化STAT3通路上調(diào)巨噬細胞脂質(zhì)受體ABCA/G1的表達
　　結(jié)論：
　　(1) DKK1能夠抑制巨噬細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積;
　　(2) DKK1通過抑制Wnt/β-catenin通路下調(diào)LOX-1的表達;
　　(3) DKK1通過活

13、化STAT3通路上調(diào)ABCA/G1的表達。
　　第三部分 DKK1對巨噬細胞自噬水平的影響及其調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的作用
　　研究背景：
　　自噬(Autophagy)是真核生物進化過程中相對保守的生命現(xiàn)象，是指細胞利用溶酶體水解酶水解細胞內(nèi)容物的過程，分為巨自噬、微自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬。巨自噬是指在饑餓等環(huán)境因素刺激下，胞質(zhì)內(nèi)形成雙層膜結(jié)構(gòu)將胞質(zhì)內(nèi)容物包裹運送至溶酶體被水解酶降解的過程;而微自噬是指溶酶體直接吞噬胞質(zhì)內(nèi)容

14、物清除的現(xiàn)象;分子伴侶介導(dǎo)的自噬，是指在分子伴侶的協(xié)助下，胞內(nèi)容物被運送至溶酶體降解的現(xiàn)象。
　　研究表明，Wnt/β-catenin通路對于基礎(chǔ)狀態(tài)和應(yīng)激狀態(tài)下的自噬水平均起到負調(diào)控的作用;而自噬活化時β-catenin能夠發(fā)生自噬性降解來抑制Wnt通路，形成一個負反饋調(diào)節(jié)。然而自噬在DKK1對脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著的作用尚未見報道。
　　研究目的：
　　(1)明確DKK1對巨噬細胞中自噬水平的影響;
　　

15、(2)明確自噬水平的改變是否參與DKK1對脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)。
　　研究方法：
　　1.細胞培養(yǎng)
　　本實驗使用單核/巨噬細胞系THP-1細胞。將THP-1細胞種板后，以PMA誘導(dǎo)為巨噬細胞作為實驗?zāi)Ｐ汀?br>　　2.細胞轉(zhuǎn)染
　　DKK1 siRNA、ATG5 siRNA和Negative control siRNA均由上海吉瑪公司合成，對細胞進行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染步驟按照Lipo-2000說明書進行。
　　

16、3.蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)
　　給予不同刺激后RIPA裂解液提取細胞蛋白，煮沸，SDS-PAGE電泳，按照對應(yīng)的分子量切膠，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，封閉，4℃一抗孵育過夜，洗膜，室溫二抗孵育1小時20分鐘，洗膜，化學(xué)發(fā)光法發(fā)光，分析蛋白條帶灰度。
　　4.巨噬細胞吞噬功能檢測
　　給予不同刺激后，加入ac-LDL刺激過夜，4％甲醛固定30分鐘，油紅O工作液染色10分鐘，洗去浮色，蘇木素染核2分鐘，鹽酸酒精去分化1

17、5秒，置于清水中返藍7分鐘后，甘油明膠封片，拍照并統(tǒng)計胞質(zhì)內(nèi)的脂質(zhì)沉積情況。細胞給予不同刺激后，加入Dil-ac-LDL避光孵育過夜，棄去培養(yǎng)基，1×PBS沖洗細胞，4％甲醛固定，1×PBS沖洗細胞，DAPI染核8分鐘，1×PBS沖洗細胞，抗熒光淬滅劑封片，共聚焦顯微鏡549nm激發(fā)波長下檢測熒光強度，以檢測巨噬細胞對Dil-ac-LDL的吞噬能力。
　　研究結(jié)果：
　　1.DKK1上調(diào)巨噬細胞中自噬的水平
　　2.D

18、KK1通過上調(diào)自噬水平來抑制巨噬細胞中的脂質(zhì)沉積
　　3.DKK1通過上調(diào)自噬水平來調(diào)節(jié)巨噬細胞脂質(zhì)受體的表達
　　4.DKK1能夠通過自噬化降解下調(diào)巨噬細胞中的β-catenin的水平
　　結(jié)論：
　　(1) DKK1能夠上調(diào)巨噬細胞的自噬水平來抑制脂質(zhì)代謝;
　　(2) DKK1通過自噬調(diào)節(jié)脂質(zhì)受體LOX-1和ABCA/G1的表達。
　　(3) DKK1能夠促進巨噬細胞中β-catenin的自噬化