CNI類免疫抑制劑對INS1細(xì)胞內(nèi)hIAPP沉積的影響及其與細(xì)胞功能相關(guān)性的研究.pdf

1、背景:在接受器官移植后CNI免疫抑制劑的長期使用的過程中，研究人員發(fā)現(xiàn)糖尿病的發(fā)生十分普遍，而關(guān)于CNI免疫抑制劑所引起的糖尿病的發(fā)生率，又有諸多文獻(xiàn)報道他克莫司（FK506）造成的糖尿病的發(fā)生率要遠(yuǎn)高于環(huán)孢霉素A(CsA)，雖然關(guān)于此種現(xiàn)象的報道十分普遍，但造成此種現(xiàn)象的機(jī)制報道十分少見，目前仍然十分不清楚為何會出現(xiàn)這種現(xiàn)象。糖尿病分為1型糖尿病和2型糖尿病，兩種糖尿病都是威脅人類健康的重大慢性非傳染性疾病之一。預(yù)計到2030年，我國

2、糖尿病新發(fā)病例將增加到1.297億，占總?cè)丝诘?2.1％。鑒于其發(fā)病率的迅猛提高和其對社會所造成的嚴(yán)重危害與醫(yī)療資源的消耗，糖尿病已然成為了我國面臨的最為突出的公共衛(wèi)生問題之一。由于目前對糖尿病的治療方法十分有限，絕大多數(shù)2型糖尿病主要依靠藥物治療，而治療1型糖尿病和少部分2型糖尿病主要方法為胰島移植或胰島素替代治療，但胰島素替代治療存在無法避免糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生等問題，同時也不能完全模擬胰島素生理模式的分泌。因此胰島移植成為了最具前景

3、的取代胰島素替代治療的方式之一，然而移植物長期存活率低仍是阻礙胰島移植發(fā)展的主要障礙。諸多學(xué)者在研究胰島移植物失去功能時，通過對因意外死亡的接受胰腺移植或胰島移植的。受者中的移植胰島的檢查發(fā)現(xiàn)，和2型糖尿病患者驚人的相似，都出現(xiàn)了人胰島淀粉樣多肽(human isletamyloid polypeptide，hIAPP)沉積。hIAPP是一種胰島β細(xì)胞內(nèi)形成并且與胰島素按照一定比例相伴分泌的一種激素，其本身具有調(diào)節(jié)糖代謝的生理作用。然而

4、，hIAPP因其本身的自身結(jié)構(gòu)特點，導(dǎo)致其具有極強(qiáng)的錯誤折疊傾向，而這種錯誤折疊一旦形成，將在胰島β細(xì)胞內(nèi)外形成沉積，進(jìn)而對β細(xì)胞的功能造成時間依賴性的嚴(yán)重?fù)p害。正因如此，關(guān)于hIAPP錯誤折疊的研究已成為國內(nèi)外學(xué)者研究2型糖尿病發(fā)病機(jī)制和胰島移植后移植物失活的熱點機(jī)制之一。因此我們推測，hIAPP錯誤折疊也是導(dǎo)致CNI類免疫抑制劑使用后所致的糖尿病的重要原因之一。然而，目前關(guān)于胰島移植后hIAPP沉積的機(jī)制研究主要集中于非免疫因素方面

5、，而關(guān)于CNI類免疫抑制劑是否會引起hIAPP沉積增加的研究目前尚無任何報道，因此，本研究希望通過hIAPP-INS1細(xì)胞模型的建立，驗證CNI類免疫抑制劑與hIAPP沉積的關(guān)系，從一個全新的角度闡明CNI免疫抑制對胰島β細(xì)胞的毒性作用機(jī)制，同時闡明CNI類免疫抑制劑促進(jìn)hIAPP沉積形成的分子機(jī)制，為使用CNI后的糖尿病及胰島移植物失功的防治提供一個新的思路。
　　方法:1、通過慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染大鼠胰島素瘤細(xì)胞系INS1，建立具有

6、puromycin抗性的新型細(xì)胞系，并經(jīng)過嘌呤霉素2μg/ml篩選10天，篩選出過表達(dá)hIAPP的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株hIAPP-INS1以及僅帶有對照組細(xì)胞株CON-INS1;通過qRT-PCR方法檢測hIAPP基因在hIAPP-INS1細(xì)胞以及CON-INS1細(xì)胞中的表達(dá)情況;利用熒光顯微鏡檢測硫代硫黃素S染色后hIAPP-INS1細(xì)胞以及CON-INS1細(xì)胞中hIAPP沉積量;利用化學(xué)發(fā)光儀檢測硫代硫黃素S染色后hIAPP-INS1細(xì)胞以及

7、CON-INS1細(xì)胞中hIAPP表達(dá)所造成的熒光強(qiáng)度;通過ELISA法測定hIAPP-INS1細(xì)胞以及CON-INS1細(xì)胞在不同濃度的葡萄糖刺激下(2mM葡萄糖、20mM葡萄糖)的葡萄糖刺激胰島素分泌能力。
　　2、利用已經(jīng)構(gòu)建成功的CON-INS1細(xì)胞和hIAPP-INS1細(xì)胞，使用不同濃度的他克莫司（0，5，10，15，20，25μg/L）和環(huán)孢霉素A（0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5μg/ml）對其培養(yǎng);通過MTS

8、法檢測不同濃度的他克莫司和環(huán)孢霉素A對CON-INS1細(xì)胞和hIAPP-INS1細(xì)胞增殖活性的關(guān)系;通過qRT-PCR方法檢測不同濃度的他克莫司和環(huán)孢霉素A對hIAPP-INS1細(xì)胞中的表達(dá)情況的影響;利用熒光顯微鏡檢測硫代硫黃素S染色后不同濃度的他克莫司和環(huán)孢霉素A對hIAPP-INS1細(xì)胞中的表達(dá)情況的影響;利用化學(xué)發(fā)光儀檢測硫代硫黃素S染色后不同濃度的他克莫司和環(huán)孢霉素A對hIAPP-INS1細(xì)胞中的hIAPP表達(dá)所造成的熒光強(qiáng)度

9、的影響;通過ELISA法測定不同濃度的他克莫司和環(huán)孢霉素A下hIAPP-INS1細(xì)胞在不同濃度的葡萄糖刺激下(2mM葡萄糖、20mM葡萄糖)的葡萄糖刺激胰島素分泌能力的影響。
　　3、利用已經(jīng)構(gòu)建成功的CON-INS1細(xì)胞和hIAPP-INS1細(xì)胞，使用他克莫司對其培養(yǎng);通過Weste n blot方法檢測他克莫司對JAK2/Foxa2/hIAPP分子信號通路的影響。
　　4、利用20μM的白藜蘆醇對hIAPP-INS1細(xì)胞

10、進(jìn)行培養(yǎng)，觀察hIAPP沉積降解情況，及GSIS變化。
　　結(jié)果:1、過表達(dá)hIAPP的大鼠胰島素瘤細(xì)胞INS1的細(xì)胞模型的建立及其模型鑒定的研究中:(1) hIAPP-INS1細(xì)胞系中的hIAPP表達(dá)情況顯著上調(diào);(2)hIAPP-INS1細(xì)胞與CON-INS1細(xì)胞相比，其熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng);(3) hIAPP-INS1細(xì)胞與CON-INS1細(xì)胞相比，其葡萄糖刺激胰島素分泌能力顯著下降。
　　2、CNI類免疫抑制劑對過表達(dá)h

11、IAPP的大鼠胰島素瘤細(xì)胞INS1的細(xì)胞模型中hIAPP沉積及其細(xì)胞功能的影響研究中:(1)隨著他克莫司使用濃度的增高，CON-INS1細(xì)胞和hIAPP-INS1細(xì)胞之間的增殖活性呈現(xiàn)顯著差異，而在使用環(huán)孢霉素A時，在任何濃度下CON-INS1細(xì)胞和hIAPP-INS1細(xì)胞之間都不存在增殖活性差異;(2)隨著他克莫司濃度增大，hIAPP-INS1細(xì)胞中綠色熒光逐漸加重，但不同濃度的環(huán)孢霉素A未見明顯變化趨勢;(3)隨著他克莫司濃度增大，

12、各組hIAPP-INS1細(xì)胞中hIAPP的mRNA表達(dá)量逐漸上調(diào)，但不同濃度的環(huán)孢霉素A藥物作用后未見明顯變化趨勢;(4)他克莫司作用下，hIAPP-INS1細(xì)胞和CON-INS1細(xì)胞相比，其葡萄糖刺激胰島素分泌能力下降趨勢十分明顯，但不同濃度的環(huán)孢霉素A藥物作用后hIAPP-INS1細(xì)胞和CON-INS1細(xì)胞相比，其葡萄糖刺激胰島素分泌能力沒有下降趨勢。
　　3、他克莫司通過刺激細(xì)胞內(nèi)Foxa2過表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)hIAPP沉積研究中

13、，他克莫司通過增加轉(zhuǎn)錄因子Foxa2表達(dá)增加hIAPP的轉(zhuǎn)錄與沉積。
　　4、白藜蘆醇可以降解細(xì)胞內(nèi)hIAPP沉積保護(hù)胰島β細(xì)胞功能。
　　結(jié)論:hIAPP-INS1細(xì)胞模型與CON-INS1細(xì)胞模型成功建立;hIAPP-INS1細(xì)胞模型的葡萄糖刺激胰島素分泌功能受到較為明顯的抑制;他克莫司對hIAPP-INS1細(xì)胞的增殖活性較環(huán)孢霉素A影響更大;他克莫司可以增加hIAPP-INS1細(xì)胞模型中hIAPP沉積量，環(huán)孢霉素A無此