免疫抑制劑沖擊治療對(duì)甲狀腺相關(guān)性眼病眼表影響的研究.pdf

1、目的：
　　對(duì)免疫抑制劑沖擊治療前后甲狀腺相關(guān)性眼病（Thyroid Associated Ophthalmopathy，TAO）患者眼表的變化進(jìn)行臨床觀察，應(yīng)用基于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LiquidChromatography-mass spectrometry/mass spectrometry，LC-MS/MS）的非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，對(duì)免疫抑制劑沖擊治療前后甲狀腺相關(guān)性眼病患者的淚液蛋白進(jìn)行定量研究，為今后甲狀腺相關(guān)性眼病

2、患者眼表?yè)p害的發(fā)病機(jī)制、早期診斷和治療提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1、篩選我院眼科就診的TAO患者及體檢中心配對(duì)的正常人進(jìn)行包括眼球突出，瞼裂高度，眨眼次數(shù)，角膜熒光染色分值，淚膜破裂時(shí)間，淚液分泌試驗(yàn)Ⅰ（Schirmer I test），眼表保護(hù)指數(shù)和眼表疾病評(píng)分的臨床觀察和記錄，用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法比較正常人與TAO患者免疫抑制劑沖擊治療前后各個(gè)觀察指標(biāo)的差異。
　　2、收集上述TAO患者沖擊治療前后和配對(duì)正?；颊叩臏I

3、液，將淚液蛋白提取，定量，分離和酶解，采用LC-MS/MS的非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選正常人與TAO患者及TAO患者沖擊治療前后的差異表達(dá)蛋白。應(yīng)用生物信息學(xué)方法[基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析和全基因組及代謝途徑數(shù)據(jù)庫(kù)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析]對(duì)差異表達(dá)顯著的蛋白進(jìn)行分析。
　　結(jié)果：
　　1、TAO患者沖擊治療前和正常人在

4、上述眼表各項(xiàng)觀察指標(biāo)上均有顯著性差異（均P<0.05）。TAO患者沖擊治療前后，其在眼球突出（p=0.083），瞼裂高度（P=0.091）指標(biāo)上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而TAO患者沖擊治療后較沖擊治療前眨眼次數(shù)明顯減少（P=0.000），角膜熒光染色分值降低（P=0.001），淚膜破裂時(shí)間顯著延長(zhǎng)（P=0.000）， SchirmerⅠ試驗(yàn)值顯著延長(zhǎng)（P=0.000），眼表疾病評(píng)分明顯降低（P=0.000）和眼表保護(hù)指數(shù)明顯增高（P=0.00

5、0）,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2、應(yīng)用非標(biāo)記定量技術(shù)在正常人和TAO患者免疫抑制劑沖擊治療前后的淚液中共鑒定出322個(gè)蛋白質(zhì)，正常人組鑒定到蛋白質(zhì)245個(gè)，TAO患者沖擊治療前共鑒定蛋白質(zhì)311個(gè)，TAO患者沖擊治療后鑒定蛋白質(zhì)300個(gè)。在TAO和正常人淚液共有的226蛋白質(zhì)中差異倍數(shù)超過4倍的有103個(gè)，99個(gè)蛋白上調(diào)，4個(gè)蛋白下調(diào)；在TAO沖擊治療前后淚液共有的276個(gè)蛋白質(zhì)中差異倍數(shù)超過2倍的有20個(gè)，11個(gè)蛋白上調(diào)，9個(gè)蛋

6、白下調(diào)。采用GO富集分析發(fā)現(xiàn)，103個(gè)正常人和TAO患者間的顯著差異蛋白在細(xì)胞和細(xì)胞器等9個(gè)細(xì)胞組分（Cellular Component）中富集，與代謝過程和應(yīng)激反應(yīng)等18個(gè)生物過程相關(guān)（Biological Process），同時(shí)涉及蛋白結(jié)合，催化活性等12項(xiàng)分子功能（Molecular Function）。KEGG細(xì)胞信號(hào)通路注釋顯示這些蛋白參與117種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其中匹配率最高的是補(bǔ)體與凝血級(jí)聯(lián)通路；20個(gè)TAO患者沖擊治療前

7、后的顯著差異蛋白在細(xì)胞和胞外區(qū)等6個(gè)細(xì)胞組分富集，參與了代謝過程、生物調(diào)節(jié)等13個(gè)生物過程，同時(shí)涉及蛋白結(jié)合、催化活性等8項(xiàng)分子功能等。KEGG結(jié)果這些蛋白參與26種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其中匹配率最高的也是補(bǔ)體與凝血級(jí)聯(lián)通路。
　　結(jié)論：
　　1、TAO患者的眼表?yè)p害明顯。免疫抑制劑沖擊治療對(duì)TAO患者的眼表?yè)p害有改善作用。TAO患者眼表?yè)p害的主要發(fā)生機(jī)制可能是炎癥機(jī)制，機(jī)械性因素為輔助因素。
　　2、首次運(yùn)用基于LC-MS

8、／MS的非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析正常人和TAO患者沖擊前后淚液的相關(guān)差異蛋白，鑒定出正常人和TAO患者淚液中差異超過4倍的上調(diào)蛋白99個(gè)、下調(diào)蛋白4個(gè)，TAO患者沖擊治療前后淚液中差異超過2倍的上調(diào)蛋白11個(gè)，下調(diào)蛋白9個(gè)。這一結(jié)果提示非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)是研究TAO淚液差異蛋白質(zhì)的有效手段。
　　3、通過生物信息學(xué)分析和注釋這些差異蛋白，發(fā)現(xiàn)他們參與代謝等生物過程，涉及到蛋白結(jié)合等分子功能，并富集于細(xì)胞等細(xì)胞成分；這些蛋白還