雷帕霉素對(duì)腎小球系膜細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的影響及機(jī)制探討.pdf

1、背景：雷帕霉素目前在腎臟病治療方面主要作為免疫抑制劑應(yīng)用于腎移植術(shù)后患者，它能明顯改善移植物的生存，但有一個(gè)明顯的副作用，即高脂血癥。另一方面，又有研究發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素具有抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用，其機(jī)理之一可能是減少血管局部巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇的積聚從而減少泡沫細(xì)胞形成。腎小球硬化在某些方面與動(dòng)脈粥樣硬化存在相似的發(fā)病機(jī)理，減少腎小球細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的過(guò)度積聚是延緩腎小球硬化發(fā)展的一個(gè)頗具吸引力的治療靶點(diǎn)。細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量與細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)的攝入及排出等多種

2、因素有關(guān)，腎小球系膜細(xì)胞(HMC)可表達(dá)低密度脂蛋白受體(LDLR)，介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)低密度脂蛋白(LDL)的攝取，表達(dá)ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子A1(ABCA1)，介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)膽固醇的流出，ABCA1的表達(dá)受過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)和肝X受體α(LXRα)的調(diào)節(jié)。正常情況下，腎小球細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)含量是受嚴(yán)格調(diào)控的，但諸如炎癥等多種病理機(jī)制可引起細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)度積聚，形成泡沫細(xì)胞。本研究觀察雷帕霉素對(duì)腎小球系膜細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的影響并從雷帕

3、霉素對(duì)細(xì)胞攝取及排出脂質(zhì)途徑的調(diào)節(jié)上探討其可能機(jī)制，旨在為雷帕霉素在臨床的進(jìn)一步應(yīng)用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 目的 觀察雷帕霉素對(duì)基礎(chǔ)狀態(tài)及炎癥狀態(tài)下腎小球系膜細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的影響及探討其機(jī)制。 方法 以腎小球系膜細(xì)胞株(HMCL)為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用油紅O染色及高效液相色譜分析法(HPLC)定性及定量觀察不同濃度雷帕霉素對(duì)對(duì)基礎(chǔ)狀態(tài)下及IL-1β作用后細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量的影響；實(shí)時(shí)熒光定量PCR法及Western印

4、跡法分別檢測(cè)不同濃度雷帕霉素對(duì)基礎(chǔ)狀態(tài)下及IL-1β作用后的HMCLLDLR、ABCA1mRNA及蛋白表達(dá)的影響。實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)不同濃度雷帕霉素對(duì)基礎(chǔ)狀態(tài)下及IL-1β作用后的HMCL細(xì)胞PPARγ和LXRαmRNA表達(dá)的影響及阻斷PPARγ和LXRα作用后雷帕霉素對(duì)HMCL細(xì)胞ABCA1mRNA表達(dá)的影響。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法探討雷帕霉素靶蛋白(mTOR)在雷帕霉素影響HMCL細(xì)胞ABCA1mRNA表達(dá)中的作用。 結(jié)

5、果 1、基礎(chǔ)狀態(tài)下200μg/mlLDL孵育HMCL，細(xì)胞內(nèi)可有少量膽固醇積聚，不同濃度雷帕霉素與200μg/mlLDL共同孵育細(xì)胞，油紅O染色檢查未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)脂滴與對(duì)照組之間有明顯差別；IL-1β5ng/ml能明顯增加細(xì)胞內(nèi)脂滴含量，雷帕霉素在10-100ng/ml濃度范圍內(nèi)均能減少IL-1β引起的細(xì)胞內(nèi)脂滴的增加。 2、HPLC定量測(cè)定示各雷帕霉素處理組細(xì)胞內(nèi)總膽固醇(TC)、游離膽固醇(FC)、膽固醇酯(CE)的濃

6、度均與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；IL-1β處理組細(xì)胞內(nèi)TC及CE的濃度分別為對(duì)照組的1.43±0.14、2.49±0.93倍，較對(duì)照組顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，10、50、100ng/ml濃度雷帕霉素組細(xì)胞內(nèi)TC含量分別為對(duì)照組的0.87±0.05、1.16±0.16、0.96±0.03倍，CE含量分別為對(duì)照組的1.12±0.10、1.58±0.29、1.53±0.60倍，較IL-1β處理組細(xì)胞內(nèi)TC及CE濃度顯著減

7、少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，各濃度雷帕霉素之間效果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，各組細(xì)胞內(nèi)FC含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3、雷帕霉素時(shí)間依賴性地調(diào)節(jié)LDLRmRNA的表達(dá)。100ng/ml雷帕霉素作用2小時(shí)，LDLRmRNA表達(dá)上調(diào)，為0小時(shí)時(shí)的2.06±0.03倍(P＜0.01)，之后LDLRmRNA表達(dá)迅速下調(diào)，在8小時(shí)時(shí)LDLRmRNA的表達(dá)量達(dá)到最低，為0小時(shí)時(shí)的0.45±0.03倍(P＜0.01)，24小時(shí)與8小時(shí)LDLR

8、mRNA表達(dá)量無(wú)明顯差異。雷帕霉素作用2h、4h、8h、24hLDLR蛋白表達(dá)量均與0小時(shí)無(wú)明星差異。 4、在作用24小時(shí)時(shí)，雷帕霉素劑量依賴性地下調(diào)LDLRmRNA的表達(dá)。10ng/ml、50ng/ml及100ng/ml組LDLRmRNA表達(dá)量分別為對(duì)照組的0.47±0.06、0.34±0.04、0.38±0.06倍，均較對(duì)照組顯著降低(P＜0.01)，其中50ng/ml作用最明顯，100ng/ml與50ng/ml無(wú)明顯差異。

9、各劑量雷帕霉素作用24小時(shí)時(shí)LDLR蛋白表達(dá)量與對(duì)照組無(wú)明顯差異。 5、IL-1β顯著上調(diào)HMCLLDLRmRNA及蛋白的表達(dá)(P＜0.01)，加用10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml雷帕霉素后LDLRmRNA及蛋白表達(dá)量呈劑量依賴性地下降，均較IL-1β單獨(dú)作用組顯著下調(diào)(P＜0.01)，其中以100ng/ml作用最明顯。 6、100ng/ml雷帕霉素時(shí)間依賴性地調(diào)節(jié)HMCL細(xì)胞ABCA1mRNA及蛋白的表

10、達(dá)，在2小時(shí)時(shí)ABCA1mRNA及蛋白表達(dá)較0小時(shí)時(shí)顯著下調(diào)(P＜0.01)，之后逐漸上調(diào)，在8小時(shí)時(shí)達(dá)到高峰，較0小時(shí)時(shí)顯著增高(P＜0.01)，24小時(shí)ABCA1mRNA及蛋白表達(dá)接近0小時(shí)水平。 7、在8小時(shí)時(shí)，雷帕霉素能劑量依賴性地上調(diào)ABCA1mRNA及蛋白的表達(dá)。10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml雷帕霉素作用后組ABCA1mRNA及蛋白表達(dá)量均較對(duì)照組顯著增加(P＜0.01)，mRNA水平以其中100n

11、g/ml作用最明顯，蛋白水平以50ng/ml作用最明顯。 8、IL-Iβ明顯下調(diào)ABCA1mRNA及蛋白的表達(dá)(P＜0.01)，加用10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml雷帕霉素后ABCA1mRNA及蛋白表達(dá)量呈劑量依賴性地增加。在mRNA水平，各劑量組ABCA1表達(dá)均較IL-1β單獨(dú)作用組顯著增加(P＜0.01)，不同濃度組之間兩兩比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)，以100ng/ml組作用最明顯。在蛋白水平，50ng

12、/ml、100ng/ml組較IL-1β單獨(dú)作用組ABCA1表達(dá)顯著增加(P＜0.01)，10ng/ml組與IL-1β單獨(dú)作用組無(wú)明顯差異。 9、100ng/ml雷帕霉素時(shí)間依賴性地調(diào)節(jié)HMCL細(xì)胞PPARγ及LXRαmRNA的表達(dá)，2小時(shí)時(shí)二者表達(dá)下調(diào)，分別為0小時(shí)時(shí)的0.63±0.04、0.49±0.04倍，與0小時(shí)相比有顯著性差異(P＜0.01)，之后逐漸上調(diào)，8小時(shí)時(shí)二者表達(dá)量達(dá)高峰，較0小時(shí)顯著增加(P＜0.01)，分別

13、為0小時(shí)時(shí)的2.42±0.05、1.99±0.06倍，24小時(shí)PPARγmRNA表達(dá)量降至接近0小時(shí)水平，LXRαmRNA表達(dá)量降至0小時(shí)時(shí)的1.68±0.04，仍較后者顯著增加(P＜0.01)。 10、在8小時(shí)時(shí)，雷帕霉素劑量依賴性地上調(diào)PPARγ、LXRαmRNA的表達(dá)，10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml組PPARγmRNA表達(dá)量分別為對(duì)照組的1.57±0.03、1.76±0.04、1.92±0.06倍，LXR

14、αmRNA表達(dá)量分別為對(duì)照組的1.45±0.05、1.73±0.07、1.34±0.04倍，均較對(duì)照組顯著增加(P＜0.01)。 11、IL-1β明顯下調(diào)PPAγ、LXRαmRNA的表達(dá)，分別為對(duì)照組的0.41±0.05、0.25±0.04倍(P＜0.01)，加用10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml雷帕霉素后PPARγ、LXRαmRNA表達(dá)量均呈劑量依賴性地增加，PPARγmRNA表達(dá)量分別為對(duì)照組的0.39±0.0

15、5、0.78±0.04、1.04±0.04倍，其中50ng/ml、100ng/ml雷帕霉素組較IL-1β單獨(dú)作用組顯著增加(P＜0.01)；LXRαmRNA表達(dá)量分別為對(duì)照組的0.55±0.03、0.54±0.06、0.78±0.04倍，均較IL-1β單獨(dú)作用組顯著增加(P＜0.01)，不同濃度組之間兩兩比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。 12、100ng/ml雷帕霉素顯著上調(diào)ABCA1mRNA的表達(dá)，為空白對(duì)照組的1.98±0

16、.04倍(P＜0.01)，PPARγ阻斷組ABCA1mRNA的表達(dá)仍顯著上調(diào)，為空白對(duì)照組的2.03±0.06倍(P＜0.01)，與雷帕霉素對(duì)照組無(wú)顯著差異；LXRα阻斷組ABCA1mRNA的表達(dá)為空白對(duì)照組的0.81±0.03倍，較空白對(duì)照組及雷帕霉素對(duì)照組均顯著下調(diào)(P＜0.01)。 13、轉(zhuǎn)染mTOR-WT、mTOR-RR、mTOR-RR-KD的細(xì)胞ABCA1mRNA表達(dá)量較轉(zhuǎn)染pcDNA3的細(xì)胞ABCA1mRNA表達(dá)量顯