Toll樣受體激動(dòng)劑和RNA干預(yù)技術(shù)對HPV 6b-11型感染的抑制作用研究.pdf

1、尖銳濕疣(Condylomaacuminatum，CA)是我國發(fā)病率最高的性傳播疾病之一，臨床上頑固難治，極易復(fù)發(fā)，嚴(yán)重危害患者的身心健康，尋求理想的治療和預(yù)防手段迫在眉睫。人乳頭瘤病毒(Humanpapillomavirus，HPV)是尖銳濕疣的病原體，其中6型和11型是CA的主要致病型別，相對于腫瘤相關(guān)的高危型HPV，主要感染皮膚和外生殖器粘膜，被稱為低危型或皮膚型HPV。HPV感染常不能有效激發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答以清除病毒感染，是HPV

2、感染難治的主要原因。如何有效抑制病毒復(fù)制，激發(fā)機(jī)體特異性抗HPV免疫應(yīng)答是控制或清除HPV感染的關(guān)鍵。HPV早期基因E7是主要致病基因之一，可引起宿主細(xì)胞增殖周期改變，并下調(diào)抑癌基因表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，因而是HPV感染防治研究的理想靶點(diǎn)。本研究以E7基因或蛋白為研究基礎(chǔ)，從調(diào)節(jié)宿主抗病毒特異性細(xì)胞免疫、和特異性沉默主要致病基因兩個(gè)方面進(jìn)行HPV感染的干預(yù)實(shí)驗(yàn)，以期為CA等低危型HPV感染相關(guān)疾病的防治研究提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

3、 Toll樣受體(Tolllikereceptors，TLRs)能特異性識(shí)別病原微生物進(jìn)化過程中保守的病原相關(guān)分子模式(pathogen-associatedmolecularpatterns，PAMPs)，啟動(dòng)天然免疫應(yīng)答并繼而激活獲得性免疫反應(yīng)。通過激活某些TLR信號(hào)通路，可促進(jìn)Th0細(xì)胞(Th，Thelper,輔助性T細(xì)胞)向Th1分化，調(diào)節(jié)T細(xì)胞亞群Th1/Th2、Tc1/Tc2的平衡，促進(jìn)抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cyto

4、toxicTlymphocyte，CTL，Tc)的活性，有利于病毒感染細(xì)胞的清除。 本研究以人外周血單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞(monocyte-deriveddendriticcells，mdDCs)負(fù)載HPV11E7抗原HLA-A*0201限制性CTL優(yōu)勢表位肽(以下簡稱E7多肽)，以不同TLR激動(dòng)劑誘導(dǎo)其成熟，分析其對mdDCs的表型、細(xì)胞因子分泌水平及其對T淋巴細(xì)胞的活化作用的影響。 結(jié)果顯示，所研究的TLR激動(dòng)劑

5、均能促進(jìn)mdDCs功能分化及成熟，促進(jìn)負(fù)載E7多肽的mdDCs(以下簡稱E7-mdDCs)分泌IL-12，尤以TLR3的激動(dòng)劑聚肌胞苷酸(polyinosinicacid-polycytidylicacid，PIC)和TLR4的激動(dòng)劑脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激作用最強(qiáng)，而TLR7的激動(dòng)劑咪喹莫特及TLR9的激動(dòng)劑胞嘧啶鳥嘌呤核苷酸序列(cytidylylphosphateguanosineoligoneu

6、leotid，CpGODN)的作用相對較弱。PIC誘導(dǎo)的E7-mdDCs能促使CD4+初始T細(xì)胞分泌高水平IFN-γ，作用明顯強(qiáng)于LPS、咪喹莫特及CpGODN組。 此外，LPS和PIC誘導(dǎo)的E7-mdDCs可提高T淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ、IL-2、TNF-α的水平以及分泌IFN-γ，IL-2的T淋巴細(xì)胞頻數(shù)，并顯著增強(qiáng)E7特異性CTL活性，作用明顯高于另兩個(gè)激動(dòng)劑咪喹莫特和CpGODN。結(jié)果提示TLR激動(dòng)劑可上調(diào)HPV11E7

7、CTL表位肽誘導(dǎo)的特異性免疫應(yīng)答，進(jìn)而有利于控制或清除HPV11型感染細(xì)胞。而在進(jìn)一步基于mdDCs的多肽疫苗研究中，TLR3和TLR4的激動(dòng)劑可能成為有效的疫苗佐劑。 特異性HPV疫苗在預(yù)防HPV感染方面顯示了高保護(hù)率，但對于免疫抑制的患者仍效果不佳，因?yàn)樗鼈冊谶@類患者體內(nèi)仍無法激發(fā)有效的免疫保護(hù)應(yīng)答，因而可能需從清除病毒本身的角度來進(jìn)行干預(yù)。RNA干擾(RNAinterference,RNAi)指雙鏈RNA在生物細(xì)胞內(nèi)對序列

8、特異性mRNA表達(dá)的抑制作用，具特異性和高效性，因而作為一種重要的基因沉默技術(shù)被廣泛應(yīng)用于基因功能研究及疾病機(jī)制和防治研究中。 本文在表達(dá)HPV6b或11型E7基因的小鼠黑素瘤細(xì)胞株BL6-B16和小鼠荷瘤模型中研究siRNA(smallinterferingRNA)和shRNA(smallhairpinRNA)質(zhì)粒表達(dá)載體對HPV基因早期基因E6、E7表達(dá)的沉默作用。特異性siRNA二聚體或shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞

9、HPV6bE7/B16和HPV11E7/B16，分析其在轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間、及不同轉(zhuǎn)染劑量下對細(xì)胞內(nèi)靶基因mRNA表達(dá)的影響。 表達(dá)HPV6b或11型E7基因的荷瘤小鼠模型則以瘤內(nèi)注射或尾靜脈注射法導(dǎo)入陽離子脂質(zhì)體負(fù)載的siRNA或shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體，注射3次后檢測腫瘤組織內(nèi)靶基因mRNA的表達(dá).檢測方法為實(shí)時(shí)熒光定量PCR。 體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，siRNA及shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體均可在體外高效特異地抑制HPV6b和11型

10、E7基因的表達(dá)，且其干預(yù)作用存在一定的量效性和時(shí)效性。SiRNA-HPV6b/11E7的最佳作用濃度為25-50nmol/L，shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體pU6-sh6b/11E7的最佳作用濃度為0.2-0.4μg/ml，靶基因表達(dá)抑制率均于72h達(dá)到最高(60％-80％)，抑制效果可持續(xù)96h。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，siRNA及shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體分別以瘤內(nèi)注射或尾靜脈注射法導(dǎo)入小鼠模型，可明顯抑制腫瘤內(nèi)E7基因的表達(dá)，且瘤內(nèi)注射較

11、尾靜脈注射效果更明顯，瘤內(nèi)注射對靶基因表達(dá)的抑制效率可達(dá)50％以上。 結(jié)果：提示siRNA及shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體在體外培養(yǎng)細(xì)胞及小鼠體內(nèi)均可有效特異地抑制HPV6b/11E7基因的表達(dá)，提示RNAi技術(shù)可通過對HPV6b/11E7基因的特異性沉默干預(yù)HPV6b/11病毒蛋白的合成、抑制蛋白功能進(jìn)而影響病毒復(fù)制乃至病毒播散。該技術(shù)將有利于CA等低危型HPV感染疾病的控制。 結(jié)論：本研究不僅提示TLR激動(dòng)劑(尤其是TLR3