NF-кB、P38MAPK在骨髓間充質(zhì)干細胞肝向分化過程中的機制研究.pdf

1、目的：探究信號傳導(dǎo)分子核因子-кB（NF-кB）和P38MAPK在參與調(diào)控肝細胞生長因子(Hepatocyte Growth Factor，HGF)為誘導(dǎo)劑的條件下體外培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞（bone mesenchymal stem cell，BMSC）向肝樣細胞定向分化的進程中，NF-кB信號通路和P38MAPK信號通路對分化的調(diào)控是否存在著某種聯(lián)系。P38MAPK作為NF-кB的上游通路，在分化的過程中是參與了NF-кB的激活。

2、r>　　方法：本實驗中所用到的骨髓間充質(zhì)干細胞來源于四周齡的雄性SD大鼠。細胞的獲取通過采用全骨髓貼壁法，利用不同細胞貼壁時間的差異，篩選出所需要的目標細胞。分離后的細胞在含10％胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，第一次換液為全換液，可以使得培養(yǎng)瓶中的大部分還沒有貼壁或者貼壁不牢的非目的細胞或狀態(tài)不佳的細胞沖出瓶外。首次換液時間為取材24小時后，之后每隔3天換一次培養(yǎng)液，當培養(yǎng)瓶中細胞融合率達到70%至80%時，使用膠原蛋白酶消化

3、，1:2傳代至新的培養(yǎng)瓶中。實驗使用傳代至第三代的骨髓間充質(zhì)干細胞作為實驗對象，使用肝細胞生長因子誘導(dǎo)細胞向肝樣細胞定向分化。實驗分為四大組：誘導(dǎo)組、NF-кB抑制組、P38MAPK抑制組以及陰性對照組。誘導(dǎo)組細胞的誘導(dǎo)環(huán)境為含有肝細胞生長因子的完全培養(yǎng)液，抑制組分為NF-кB抑制組和P38抑制組，這兩組細胞是在HGF誘導(dǎo)組的基礎(chǔ)上分別添加了 NF-кB信號分子的抑制劑 BAY11-7082和P38MAPK信號分子的抑制劑 SB2035

4、80，其他培養(yǎng)環(huán)境和培養(yǎng)時間相同。陰性對照組細胞培養(yǎng)環(huán)境為含有10％胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基。取培養(yǎng)20天后的細胞進行靛青綠（ICG）攝取實驗檢測已分化的肝細胞，蛋白質(zhì)印跡檢測NF-кB、p-P38和α1-抗胰蛋白酶（α1-antitrypsin，AAT）的表達，取培養(yǎng)第7天和第20天的細胞進行免疫組化染色檢測NF-кB蛋白。
　　結(jié)果：誘導(dǎo)20天后，HGF誘導(dǎo)組中的大部分細胞呈圓形或卵圓形肝樣細胞狀生長，靛氰綠實驗發(fā)現(xiàn)這些細

5、胞可攝取ICG，并在一定時間內(nèi)將ICG排出胞體外，免疫印跡實驗結(jié)果顯示有特異的肝細胞標志物α1-抗胰蛋白酶AAT的表達，免疫組化結(jié)果顯示，細胞培養(yǎng)7天時和20天時，細胞核內(nèi)都有NF-кB的聚集，NF-кB在此過程中激活轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)；NF-кB抑制組和P38抑制組中細胞與對誘導(dǎo)組比，NF-кB抑制劑BAY11-7082和P38抑制劑SB203580的抑制效果明顯，細胞對ICG的攝取和表達的α1-抗胰蛋白酶蛋白表和誘導(dǎo)組相比來看都有比較明