乙肝患者TGFβ1基因多態(tài)性及與血清肝纖維化指標(biāo)的關(guān)系.pdf

1、目的肝硬化是臨床常見(jiàn)病，死亡率很高，目前尚無(wú)特效治療方法。肝纖維化是慢性肝病發(fā)展到肝硬化的必經(jīng)之路，阻斷肝纖維化形成對(duì)改善肝硬化預(yù)后有重要意義，肝纖維化防治是臨床研究的熱點(diǎn)、難點(diǎn)。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGFβ1)是一種具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、死亡或凋亡、細(xì)胞分化和細(xì)胞外基質(zhì)合成等多種生物學(xué)功能的細(xì)胞因子，在肝臟細(xì)胞外基質(zhì)的合成、沉積及降解的過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，與肝纖維化的發(fā)生機(jī)制有著密切的關(guān)系。臨床上我們觀察到乙肝肝纖維化的形成具有一定的

2、個(gè)體差異，可能與患者的遺傳背景有關(guān)，血清TGFβ1的水平可能受其基因多態(tài)性的影響。國(guó)外研究報(bào)道TGFβ1+869(T/C)、+915(G/C)的多態(tài)性可影響丙型肝炎病毒(HCV)感染后肝纖維化的發(fā)生及肝組織炎癥和纖維化病變程度，為明確TGFβ1基因多態(tài)性與乙肝患者血中TGFβ1水平及與乙肝肝纖維化的關(guān)系，進(jìn)一步從基因水平上探討、認(rèn)識(shí)肝纖維化的發(fā)生機(jī)制，為今后肝纖維化基因治療提供新的理論依據(jù)，故我們選擇+869(T/C)、+915(G/C

3、)位點(diǎn)進(jìn)行了此項(xiàng)研究。 方法一、研究對(duì)象1、慢性肝炎組65例慢性乙型病毒性肝炎患者，男50例、女15例，年齡18～68(36.22±11.67)歲，其中輕度12例、中度37例、重度16例，病程6月～20年，平均(3.36±4.91)年，其中有乙肝家庭聚集傾向36例。 2、肝硬化組56例乙肝肝硬化患者，男50例、女6例，年齡30～77(50.88±11.33)歲，代償期26例、失代償期30例，病程7月～32年，平均(4.1

4、5±5.61)年，其中有乙肝家庭聚集傾向45例。 上述兩組病例均選自2004年7月～2005年12月收住院我醫(yī)院感染病科的乙型病毒性肝炎患者，診斷符合2000年全國(guó)肝病年會(huì)議制定的《病毒性肝炎防治方案》標(biāo)準(zhǔn)。 3、正常對(duì)照組均系體檢健康、乙肝標(biāo)志物陰性者，共50例，男35例、女15例，年齡18～65(48.72±12.90)歲。 所有研究對(duì)象采血前6月內(nèi)均無(wú)使用抗病毒和抗肝纖維化藥物，除外甲、丙、丁、戊型病毒性肝

5、炎、酒精性肝病、藥物性肝炎等肝病，并除外腎小球硬化等纖維硬化性疾病，無(wú)血液病，入院前1月無(wú)感染、無(wú)組織損傷史。 二、研究方法1、標(biāo)本采集空腹采血6ml，其中3ml用EDTA抗凝，放入-80℃冰箱保存，集中檢測(cè)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1基因多態(tài)性；另3ml血不抗凝，離心分離出血清保存于-80℃冰箱，集中檢測(cè)血清轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1水平及肝纖維化指標(biāo)。 2、TGFβ1+869T/C、+915G/C基因類(lèi)型檢測(cè)：用PCR-DNA測(cè)序技術(shù)。(

6、1)全血基因組DNA抽提；(2)PCR擴(kuò)增目的基因。引物序列：①869T/C15′-AGCAGCGGTAGCAGCAGCA-3′②869T/C25′-GCAGCGGTAGCAGCAGCG3′③869T/C35′-GTCACCAGAGAAAGAGGAC-3′④915G/C15′-GTGCTGACGCCTGGCCG-3′⑤915G/C25′GTGCTGACGCCTGGCCC-3′⑥915G/C35′-GGCTCCGGTTCTGCACTC-3

7、′。(3)PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖(Agarose)Ⅱ電泳，電壓(180V,40mA)。(4)等位基因類(lèi)型的確定：特異性擴(kuò)增結(jié)果與測(cè)序結(jié)果相對(duì)照，最終確定各個(gè)樣本的等位基因類(lèi)型。3、血清TGFβ1檢測(cè)：采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)。 4、血清肝纖維化指標(biāo)檢測(cè)：選擇透明質(zhì)酸(HA)、層粘連蛋白(LN)、Ⅳ型膠原(CⅣ)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)作為肝纖維化指標(biāo)，采用放免法測(cè)定。 三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件

8、進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果一、TGFβ1+869T/C和+915G/C基因類(lèi)型及等位基因頻率在三組的分布情況：+869T/C可見(jiàn)3種基因類(lèi)型：TT，TC，CC。+915G/C觀察到GG，GC，CC基因類(lèi)型.在+869位點(diǎn)上，慢性肝炎組、肝硬化組兩組的CC基因類(lèi)型及C等位基因的分布頻率(慢性肝炎組分別為0.277、0.577，肝硬化組分別為0.250、0.545)顯著高于對(duì)照組(0.100、0.400)，均P＜0.05，而慢性肝炎組、肝硬化組兩組

9、間則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異。在+915位點(diǎn)上，慢性肝炎組、肝硬化組GC、CC基因類(lèi)型及C等位基因分布頻率高于正常對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 二、血清TGFβ1水平與+869T/C基因類(lèi)型及血小板計(jì)數(shù)的關(guān)系：經(jīng)協(xié)方差分析，+869T/C基因類(lèi)型及血小板計(jì)數(shù)對(duì)血清TGFβ1水平均有顯著性影響，均P＜0.05，CC基因類(lèi)型、TC基因類(lèi)型、血小板計(jì)數(shù)對(duì)血清TGFβ1水平影響的回歸系數(shù)值分別為12.034、4.027、0.042，CC基因類(lèi)型

10、對(duì)TGFβ1水平影響起主導(dǎo)作用。三、血清TGFβ1水平與+915G/C基因類(lèi)型的關(guān)系 +915G/C位點(diǎn)GG、GC、CC基因類(lèi)型三組血清TGFβ1水平相仿，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05。 四、TGFβ1+869T/C、+915G/C基因類(lèi)型及等位基因頻率分布與慢性乙肝或乙肝后肝硬化家庭聚集傾向的關(guān)系：在慢性肝炎、肝硬化患者中，有慢性乙肝或乙肝后肝硬化家庭聚集傾向組TGFβ1+869T/C位點(diǎn)CC基因類(lèi)型及C等位基因的分

11、布頻率(0.346、0.611)顯著高于無(wú)家庭聚集傾向組(0.100、0.462)，均P＜0.05；而在+915G/C位點(diǎn)GG、GC、CC基因類(lèi)型及G、C等位基因的分布頻率在有、無(wú)乙肝家庭聚集傾向兩組中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05。 五、慢性肝炎組、肝硬化組和正常對(duì)照組血清TGFβ1水平(ng/ml)比較：慢性肝炎組血清TGFβ1水平(21.55±12.62)顯著高于正常對(duì)照組(11.05±8.90)，P＜0.05；肝硬化組(

12、9.77±9.04)與正常對(duì)照組相仿，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；失代償期肝硬化組(6.89±6.76)顯著低于代償期肝硬化組(13.08±11.85)，P＜0.05。 六、慢性肝炎組、肝硬化組和正常對(duì)照組血清肝纖維化指標(biāo)(ng/ml)比較：四種血清肝纖維化指標(biāo)HA、LN、CⅣ、PCⅢ，慢性肝炎組(313.49±285.71，109.51±35.31，111.77±102.29，233.82±131.36)、肝硬化組(712.38±265

13、.80，127.20±44.35，155.80±74.83，237.48±126.46)均顯著高于對(duì)照組(63.16±24.89，72.08±24.75，48.72±18.12，62.14±24.23)，均P＜0.05。 結(jié)論一、本組研究表明TGFβ1+869(T/C)基因存在多態(tài)性，慢性乙型肝炎組、乙肝肝硬化組CC基因類(lèi)型、C等位基因頻率分布明顯高于正常對(duì)照組；CC基因類(lèi)型與血清TGFβ1水平呈明顯正相關(guān)。 二、本組研