創(chuàng)傷膿毒癥遺傳易感性的分子流行病學(xué)與臨床關(guān)聯(lián)研究.pdf

1、研究背景：創(chuàng)傷是嚴重危害人類健康的公共衛(wèi)生難題，是45歲以下人群的主要死亡原因。創(chuàng)傷引發(fā)的膿毒癥和多器官功能障礙(MODS)等并發(fā)癥是患者死亡的嚴重威脅。因此，如何盡早甄別出罹患膿毒癥和MODS的高危患者，給予及早預(yù)防和針對性治療是提高嚴重創(chuàng)傷患者預(yù)后的關(guān)鍵。臨床和實驗研究表明創(chuàng)傷后機體的免疫應(yīng)答反應(yīng)具有個體異質(zhì)性，創(chuàng)傷膿毒癥和MODS的發(fā)生與機體遺傳背景尤其是單核甘酸多態(tài)性存在密切的內(nèi)在聯(lián)系，即不同遺傳背景的創(chuàng)傷個體，存在膿毒癥易患性

2、、臨床嚴重程度與預(yù)后及治療反應(yīng)的差異性。因此，從遺傳背景著手深入研究創(chuàng)傷后的炎癥反應(yīng)規(guī)律、膿毒癥發(fā)生發(fā)展的相關(guān)遺傳信息，將為評估和預(yù)警創(chuàng)傷膿毒癥的發(fā)生風(fēng)險性、治療反應(yīng)或預(yù)后建立有效、快捷的分子遺傳學(xué)診斷指標和技術(shù)。本研究目的是探索和發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷膿毒癥易患性相關(guān)的基因多態(tài)性。首先基于已發(fā)表的膿毒癥遺傳關(guān)聯(lián)研究，從循證醫(yī)學(xué)角度進行系統(tǒng)評價和meta分析，全面、充分理解膿毒癥發(fā)生的遺傳背景；其次采用候選基因策略選擇一些重要的免疫炎癥調(diào)控基因在臨床

3、多中心創(chuàng)傷人群中繼續(xù)探索新的膿毒癥高?；蚨鄳B(tài)性位點及其生物學(xué)功能，為探索創(chuàng)傷膿毒癥預(yù)警診斷方法提供依據(jù)。
　　材料與方法：1.采用(sepsis OR "septic shock" OR septicemia) AND (polymorphism OR variationOR mutation)在Pubmed、Medline、Embase、Web of Science和HuGE等醫(yī)學(xué)文獻數(shù)據(jù)庫中檢索和篩選基因多態(tài)性與膿毒癥發(fā)生風(fēng)

4、險的遺傳關(guān)聯(lián)研究相關(guān)文獻，針對≥2個研究人群的基因多態(tài)性位點在顯性模式、隱性模式和等位基因模式下采用meta分析方法評估與膿毒癥發(fā)生風(fēng)險的關(guān)聯(lián)強度，并根據(jù)人群種族進行分層分析。最后采用異質(zhì)性分析、敏感性分析、發(fā)表偏倚檢驗和威尼斯等級標準評價關(guān)聯(lián)結(jié)果的可靠性和穩(wěn)定性。 2.從HapMap數(shù)據(jù)庫下載NLRP3、SOCSs和microRNAs全基因及其延伸范圍內(nèi)的SNP在中國北京漢族人群中的基因型數(shù)據(jù)，采用 TAGster軟件計算連鎖不平衡r

5、2值（r2≥0.8）和構(gòu)建單倍型bin圖譜，從每一個bin內(nèi)挑選一個能夠代表整個bin內(nèi)SNP信息的標簽 SNP。此外，通過miRNA二級結(jié)構(gòu)構(gòu)象和靶基因預(yù)測分析挑選具有潛在功能性的pre-miRNASNP。 3.在連續(xù)收集的1408例(重慶地區(qū)806例、云南地區(qū)286例、浙江地區(qū)316例)中國漢族嚴重創(chuàng)傷患者中采用焦磷酸測序法進行SNP位點的基因型檢測。計數(shù)各SNP的基因型分布，采用卡方檢驗計算哈溫平衡、顯/隱性遺傳模式下各基因型與膿

6、毒癥發(fā)生率之間的關(guān)系，單因素方差分析各基因型與MOD評分的關(guān)系，logistic回歸和線性回歸分別分析SNP與創(chuàng)傷后膿毒癥或MOD評分之間的等位基因劑量效應(yīng)，并進行年齡、性別及ISS等混雜因素的校正。 4.采集創(chuàng)傷后2小時內(nèi)和健康自愿者外周血，在37℃條件下LPS（100ng/ml）孵育4小時，分離血漿和白細胞。采用ELISA檢測創(chuàng)傷患者血漿中細胞因子的表達水平，采用Real-time PCR檢測LPS刺激的健康自愿者外周血細胞中CIS

7、表達水平 5.通過構(gòu)建野生型和突變型含有rs2027432-1017G/A、rs414171-237A/T的NLRP3或CIS啟動子的pGL3質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染人類模式細胞系，采用熒光素酶報告基因系統(tǒng)觀察rs2027432-1017G/A、rs414171-237A/T分別對靶基因NLRP3、CIS啟動子活性影響。相似的，通過構(gòu)建野生型和突變型的miR-608表達載體、轉(zhuǎn)染細胞和TaqMan探針法觀察rs4919510G/C對成熟miR-608

8、的表達影響。
　　結(jié)果：1.按照預(yù)定的納入標準從8796篇文獻中篩選出232篇膿毒癥遺傳關(guān)聯(lián)研究。對56個基因123個多態(tài)性位點的meta分析發(fā)現(xiàn)17個基因21個多態(tài)性位點在不同的遺傳模式下與膿毒癥發(fā)生率密切相關(guān)，其中強關(guān)聯(lián)位點5個，分別是NOD2rs2066844C/T、LBP rs2232618T/C、TNFA rs361525G/A、IL-10rs1800894、SETPDrs12219080；中等關(guān)聯(lián)強度位點6個，分別是T

9、LR1rs5743611G /C、RAGE rs1800625T/C、MD2rs11465996C/G、IL-12B rs2195940、PBEF rs61330082T/C、SFTPD rs1998374。根據(jù)流行病學(xué)累計證據(jù)等級劃分沒有基因多態(tài)性位點的證據(jù)等級達到強度，5個位點為中等，其余位點為微弱等級。通過亞組分析額外發(fā)現(xiàn) IL-10rs1800896在亞洲人群中與膿毒癥發(fā)生風(fēng)險呈較弱關(guān)聯(lián)性，流行病學(xué)累計證據(jù)等級為微弱等級。此外，

10、對僅有一組研究數(shù)據(jù)的94個基因177 個多態(tài)性位點分析發(fā)現(xiàn)31個基因的42個多態(tài)性位點與膿毒癥發(fā)生風(fēng)險密切相關(guān)，這些關(guān)聯(lián)性需要更大研究人群和檢驗功效的研究去證實。 2.基于中國北京漢族人群中的SNP基因型數(shù)據(jù)，通過構(gòu)建單倍型bin圖譜從35個NLRP3SNPs中挑選6個標簽SNP；采用相同的方法根據(jù)連鎖不平衡強度（r2值）從7個SOCS基因145個SNPs中挑選12個標簽SNP。此外，通過miRNA二級結(jié)構(gòu)和靶基因預(yù)測分析從26個pre

11、-miRNA SNPs中挑選9個潛在功能性的SNP。總計在NLRP3、SOCSs和pre-miRNA基因范圍內(nèi)挑選出27個具有代表性和潛在功能性的SNP。 3.在6個NLRP3標簽SNP中，在重慶創(chuàng)傷人群中兩個SNP（srs2027432-1017G/A、rs12048215+5134A/G)與創(chuàng)傷膿毒癥和MODS的發(fā)生密切相關(guān)，顯示A等位基因攜帶者創(chuàng)傷后發(fā)生膿毒癥和MODS的機率明顯增高，LPS誘導(dǎo)的血漿IL-1β表達升高；但兩個SN

12、P并無協(xié)同效應(yīng)。
　　結(jié)論：本課題首次針對已發(fā)表的膿毒癥易患性遺傳關(guān)聯(lián)研究進行較為系統(tǒng)、全面的meta分析闡明膿毒癥發(fā)生風(fēng)險的高危基因多態(tài)性位點。同時通過臨床多中心創(chuàng)傷患者的遺傳關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn) NLRP3 rs2027432、rs12048215，CIS rs414171，SOCS7 rs3748726 和miR-608 rs4919510 等5個新的與創(chuàng)傷后膿毒癥或 MODS 發(fā)生密切相關(guān)的基因多態(tài)性位點。為探尋創(chuàng)傷膿毒癥的分子遺