全新VEGF受體抑制劑的設(shè)計(jì)與合成研究.pdf

1、惡性腫瘤是當(dāng)前嚴(yán)重影響人類健康、威脅人類生命的主要疾病之一,世界衛(wèi)生組織和各國政府衛(wèi)生部門都把攻克癌癥列為一項(xiàng)首要任務(wù)。目前,臨床上常用的抗癌藥物主要是細(xì)胞毒類藥物,這類藥物因其細(xì)胞毒的固有性質(zhì)而具有難以避免的選擇性差、毒副作用強(qiáng)、易產(chǎn)生耐藥性等缺點(diǎn)。因此,尋找特異性高、毒性小、病人耐受性好的新靶標(biāo)就成為抗癌藥物研究的迫切需要。近年來,隨著生命科學(xué)研究的飛速發(fā)展,眾多基于癌細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的特異性靶點(diǎn)被鑒定出來,如：參與胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的

2、蛋白酪氨酸激酶(PTK)、蛋白激酶C(PKC)、法尼基轉(zhuǎn)移酶(Ftase),參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK),誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞調(diào)亡的Bcl-2蛋白,抑制腫瘤血管生成的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF),參與胞外基質(zhì)降解和重建的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)等。尋找選擇性作用于這些特異性靶點(diǎn)的高效、低毒、專屬性強(qiáng)的新型抗癌藥物已成為當(dāng)今抗腫瘤藥物研究的主要方向。 血管生成(angiogenesis)是指從已存在的血管上發(fā)育出

3、新的血管系統(tǒng)。正常的血管生成只在某些短期、特定的生理過程中存在,如生殖、傷口愈合等。而異常的血管生成則是腫瘤、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病性視網(wǎng)膜病變等惡性疾病的病理表現(xiàn)之一。自從Folkman(1933-2008)提出血管生成與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的假說以來,大量的臨床實(shí)踐與實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)了抑制腫瘤介導(dǎo)的血管生成可以有效地抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。今天,已有10個(gè)抑制血管生成的抗癌藥物上市,全球有超過120萬人接受抗血管生成治療。 VEG

4、F受體是抗血管生成的重要靶標(biāo)。近年來,靶向VEGF受體的小分子抑制劑的研究非?；钴S,大量結(jié)構(gòu)各異的抑制劑被報(bào)道出來,具代表性的有2-吲哚酮類,4-苯胺基喹唑啉類和2,4-二氮雜萘類等。其中一些化合物已分別進(jìn)入各期臨床評(píng)價(jià),顯示出良好的應(yīng)用前景。但目前這些抑制劑仍存在一些問題,例如它們都是ATP的競爭性抑制劑,而細(xì)胞內(nèi)尤其是癌細(xì)胞內(nèi)的ATP濃度能達(dá)到5mmol/L以上,因此抑制劑活性應(yīng)至少達(dá)到納摩爾級(jí)水平才能表現(xiàn)出有效的抑制作用。另外,V

5、EGF受體屬于酪氨酸激酶超家族,該家族成員廣泛參與體內(nèi)生物信號(hào)的傳導(dǎo)。由于序列的同源性,它們的ATP結(jié)合位點(diǎn)的三維結(jié)構(gòu)是高度保守的。因此如何提高抑制劑在這些家族成員中的選擇性也是一個(gè)研究重點(diǎn)。所以,尋找高活性,高選擇性的VEGF受體抑制劑仍是今后的研究方向。隨著計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)技術(shù)的廣泛應(yīng)用,VEGF受體的結(jié)構(gòu)和功能以及與抑制劑的作用機(jī)制的逐漸闡明,VEGF受體抑制劑的開發(fā)正由隨機(jī)篩選轉(zhuǎn)為合理藥物設(shè)計(jì)(SBDD)。 本課題旨在

6、應(yīng)用計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)技術(shù)和化學(xué)合成手段,在全面探測(cè)VEGF受體活性腔的性質(zhì)、深入探討受體與抑制劑的作用模式的基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)、合成新型的VEGF受體抑制劑先導(dǎo)化合物,為發(fā)現(xiàn)新型高效、低毒的抗癌藥物打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。為此,我們主要進(jìn)行了以下幾方面的工作： 一、VEGFR-2活性腔性質(zhì)的研究 活性腔的性質(zhì)以及與配體結(jié)合相關(guān)的關(guān)鍵殘基是基于結(jié)構(gòu)合理藥物設(shè)計(jì)的基礎(chǔ),但目前仍沒有對(duì)VEGFR-2活性腔進(jìn)行全面深入分析的報(bào)道。為此,我們

7、首先運(yùn)用活性位點(diǎn)搜尋工具(Binding Site Analysis)確定了VEGFR-2活性腔的形狀與大小,然后采用多拷貝同時(shí)搜尋法(MCSS)對(duì)VEGFR-2活性腔進(jìn)行分析,計(jì)算結(jié)果顯示活性腔可分為3個(gè)疏水性區(qū)域和1個(gè)極性區(qū)域:I區(qū)為與絞鏈區(qū)毗鄰的一個(gè)扁平的,由Val846,Ala864,Val897,Val914,Phe916,Leu1033的疏水性側(cè)鏈組成的疏水腔。II區(qū)是由Ile886,Leu887,Ile890,Val896

8、,Val897,Leu1017,Ile1042,Phe1047的疏水性側(cè)鏈組成的1個(gè)較大的疏水腔。位于I區(qū)和II區(qū)之間的由Lys866,Glu883的極性側(cè)鏈和Asp1044的骨架羰基氧組成環(huán)狀極性區(qū)域?qū)τ谂潴w的結(jié)合也很重要。Ⅲ位于活性腔開口向溶劑的位置,是由Leu838和Phe916的側(cè)鏈組成的小的疏水性區(qū)域。IV區(qū)是由Asn921,Leu1033,Cys1043的疏水性殘基和Arg1030,Asn1031的親水性殘基組成的一個(gè)極性區(qū)

9、域。其中Arg1030側(cè)鏈上的N-H也是關(guān)鍵的氫鍵供體位點(diǎn)。這些結(jié)果與眾多文獻(xiàn)報(bào)道的抑制劑與VEGFR-2的結(jié)合模式一致。 為了考察VEGFR-2活性腔在與配體結(jié)合前和結(jié)合后的構(gòu)象差異,即受體與配體的誘導(dǎo)契合作用,我們對(duì)已公布的VEGFR-2游離態(tài)晶體結(jié)構(gòu)和8個(gè)復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了全面的比較。將這9個(gè)晶體結(jié)構(gòu)活性腔范圍內(nèi)的肽鏈的Cα原子進(jìn)行疊合,計(jì)算其RMSD值,比較它們之間的異同。結(jié)果發(fā)現(xiàn)活性腔內(nèi)I區(qū)、Ⅲ區(qū)和IV區(qū)內(nèi)的肽鏈骨架

10、以及殘基側(cè)鏈的變化均較小,而II區(qū)內(nèi)活化環(huán)的起始端DFG序列的構(gòu)象有顯著的差異,其中Phe1047側(cè)鏈的空間取向在不同的復(fù)合物中也完全不同。這些構(gòu)象變化改變了II區(qū)的形狀和大小,這提示我們?cè)谀MVEGFR-2與抑制劑的結(jié)合模式時(shí)考慮II區(qū)的柔性變化對(duì)獲得準(zhǔn)確的結(jié)果是非常重要的。 二、VEGFR-2與抑制劑結(jié)合模式的分子模擬 研究不同類型抑制劑與靶酶的結(jié)合方式對(duì)于深刻理解受體-配體相互作用制可以提供豐富的信息,而目前文獻(xiàn)對(duì)

11、此的報(bào)道卻是分散的和不全面的。因此我們采用柔性分子對(duì)接技術(shù)對(duì)已報(bào)道的各類VEGFR-2抑制劑與VEGFR-2活性腔進(jìn)行對(duì)接研究,考察它們與受體結(jié)合特點(diǎn)的異同,確定參與配體結(jié)合的關(guān)鍵殘基及其空間取向。結(jié)果發(fā)現(xiàn):I區(qū)中有2個(gè)關(guān)鍵的氫鍵作用位點(diǎn):Glu917骨架上的C=O作為氫鍵受體,Cys919骨架上的N-H作為氫鍵供體,絕大部分抑制劑都與這一個(gè)或兩個(gè)氫鍵位點(diǎn)發(fā)生相互作用。Lys868、Glu885和Asp1046形成的極性區(qū)域?qū)μ岣吲潴w親

12、合力很重要,疏水腔Ⅲ和極性腔IV是額外增強(qiáng)配體結(jié)合力的區(qū)域,IV區(qū)的Asn923可提供額外的氫鍵作用位點(diǎn)。在此基礎(chǔ)上,我們采用LIQUID程序建立了VEGFR-2受體的三維藥效團(tuán)模型,它包含與受體結(jié)合關(guān)鍵的10個(gè)藥效點(diǎn)。藥效團(tuán)模型直觀地反映了各關(guān)鍵的藥效點(diǎn)的空間分布以及彼此之間的關(guān)系,可為新抑制劑的設(shè)計(jì)提供參考和思路。 三、全新VEGFR-2抑制劑的設(shè)計(jì) 根據(jù)以上研究結(jié)果,我們將已報(bào)道的抑制劑拆分成小分子片段,用LUDI

13、搜尋各個(gè)小片段在活性腔中相應(yīng)區(qū)域內(nèi)最佳的結(jié)合構(gòu)象和空間取向,再分別連接這些最佳取向的小片段生成配體分子,再用柔性分子對(duì)接軟件Affinity評(píng)價(jià)這些新生成的分子與活性腔的親合力,最后用人工撿視揀選合成可行的目標(biāo)化合物。最終,我們揀選出兩類分子3,4-二氫異喹啉類和1-異喹啉酮類進(jìn)行有機(jī)合成。 四、新型VEGFR-2抑制劑的合成與活性研究 在本節(jié)中,我們共合成了24個(gè)異喹啉類化合物,除化合物22,23外,其它目標(biāo)化合物均為

14、首次報(bào)道,所有目標(biāo)化合物均經(jīng)1HNMR、質(zhì)譜、紅外結(jié)構(gòu)確定。3,4-二氫異喹啉類的通用合成方法是：3,4,5-三甲氧基苯甲醛與硝酸甲烷縮合成硝基苯乙烯,然后用LiAlH4還原成3,4,5-三甲氧基苯乙胺,再跟各種取代的苯甲酰氯制成酰氨,再經(jīng)Bischler-Napieralski環(huán)合制得目標(biāo)產(chǎn)物,總收率33％。產(chǎn)物還可進(jìn)一步經(jīng)鈀碳脫氫制成芳構(gòu)的異喹啉或用NaBH4還原成1,2,3,4-四氫異喹啉。1-異喹啉酮類的通用合成方法是：高鄰苯二

15、甲酸與氨水制成銨鹽,高溫脫水制得高鄰苯二酰亞胺,然后與各種取代的苯甲醛經(jīng)Knoevenagel縮合、NaBH4還原、稀鹽酸水解制得目標(biāo)產(chǎn)物,總收率9％。 采用了人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞抑制實(shí)驗(yàn)和雞胚尿囊膜實(shí)驗(yàn)考察了目標(biāo)化合物的抗血管生成活性。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：本類異喹啉類化合物具有一定的的抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的活性。其中活性最強(qiáng)的化合物6的IC50達(dá)到了3.14μmol/L。雞胚尿囊膜實(shí)驗(yàn)表明目標(biāo)化合物具有不同程度的抑制