胚胎期宮內(nèi)移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對顯性脊柱裂胎鼠脊髓VEGF-A和PDGF-A表達(dá)影響的研究.pdf

1、目的:
　　 神經(jīng)管畸形(Neural tube defects,NTDs)是常見的嚴(yán)重出生缺陷,是由于神經(jīng)管閉合異常所致,主要包括無腦、腦膨出和脊柱裂等,其病因及發(fā)病機(jī)制不清楚。目前研究認(rèn)為是胚胎發(fā)育過程中多種基因調(diào)控異常和環(huán)境有害因素共同作用的結(jié)果。由于畸形改變嚴(yán)重,目前尚無良好的治療方法。然而,干細(xì)胞移植技術(shù)的出現(xiàn)打破了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)細(xì)胞不能再生的禁錮,為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療帶來生機(jī)和希望。其中,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mes

2、enchymal stem cells,MSCs)作為一種成體干細(xì)胞,不僅具有向中胚層間質(zhì)細(xì)胞分化的能力,在一定條件或微環(huán)境中還可向外胚層或內(nèi)胚層細(xì)胞分化,并可能對脊髓損傷、腦外傷、腦變性疾病、腦缺血、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常等疾病的神經(jīng)功能缺損有治療作用,被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞移植、基因治療和組織工程方面的研究。因此,MSCs可以作為組織工程較理想的種子細(xì)胞來源,MSCs移植治療先天性脊椎裂可望成為治療神經(jīng)系統(tǒng)先天發(fā)育畸形最有前途的方法之一。

3、>　　 血管內(nèi)皮生長因子-A(vascular endothelial growth factor-A,VEGF-A)和血小板源性生長因子-A(platelet-derived growth factor-A,PDGF-A)與腦部腫瘤、腦血管病和神經(jīng)系統(tǒng)先天發(fā)育畸形等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生相關(guān),在體內(nèi)可產(chǎn)生一系列的生物學(xué)效應(yīng),如細(xì)胞分化、趨化和凋亡等,已經(jīng)成為神經(jīng)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。
　　 本實驗采用維甲酸致畸建立先天性脊柱裂胎鼠

4、模型,結(jié)合胎仔外科,顯微外科和顯微注射等技術(shù)進(jìn)行骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)移植,觀察MSCs對顯性脊柱裂胎鼠脊髓中VEGF-A和PDGF-A的表達(dá)變化規(guī)律影響,證實移植MSCs對顯性脊柱裂胎鼠的治療作用。
　　 方法:
　　 1、建立先天性脊椎裂胎鼠動物模型:將孕10天大鼠按135mg/Kg體重灌胃法給予4％維甲酸,制作先天性脊椎裂動物模型。
　　 2、原代培養(yǎng)MS

5、Cs及腺病毒-GFP轉(zhuǎn)染:無菌條件下取大鼠骨髓MSCs,用全骨髓貼壁培養(yǎng)法進(jìn)行原代培養(yǎng),腺病毒-EGFP(MOI值300-500)轉(zhuǎn)染MSCs。
　　 3、干細(xì)胞移植:利用胎仔外科方法將轉(zhuǎn)染GFP的MSCs在孕16天經(jīng)纖細(xì)玻璃針注射到先天性脊椎裂胎鼠的脊髓中,并存活至20天,剖宮取胎。
　　 4、Real-time PCR法檢測各組VEGF-A和PDGF-A mRNA表達(dá)情況:將同一孕鼠的胎鼠分為給藥無畸形組、脊柱裂畸形

6、組、給藥無畸形MSCs移植組,脊柱裂MSCs移植組和脊柱裂空白移植組五組,分別應(yīng)用Real-Time PCR技術(shù)進(jìn)行VEGF-A和PDGF-A mRNA表達(dá)的檢測。
　　 5、統(tǒng)計學(xué)分析:采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析,兩組間比較應(yīng)用t檢驗,多組問比較采用one-way ANOVA分析,以P＜0.05表示有顯著性差異。
　　 結(jié)果:
　　 1、移植后孕鼠和胎鼠的存活情況;
　　 被移植孕鼠共20只

7、,2只孕鼠16天移植后死亡,孕鼠存活率90％,存活并得到胎鼠標(biāo)本共45只,其中給藥無畸形胎鼠9只、脊柱裂畸形胎鼠10只、給藥無畸形MSCs移植胎鼠9只,脊柱裂畸形MSCs移植胎鼠10只和畸形空白移植胎鼠7只。
　　 2、通過Real-Time PCR技術(shù)檢測各組VEGF-A和PDGF-A mRNA表達(dá)情況;
　　 (1)脊柱裂畸形組VEGF-A和PDGF-A mRNA表達(dá)水平明顯低于給藥無畸形組,且有統(tǒng)計學(xué)意義,說明VE

8、GF-A和PDGF-A在顯性脊柱裂畸形組表達(dá)明顯下調(diào)。
　　 (2)脊柱裂畸形MSCs移植組VEGF-A和PDGF-A mRNA表達(dá)水平明顯高于畸形組和畸形空白移植組,且有統(tǒng)計學(xué)意義,說明通過MSCs移植治療后VEGF-A和PDGF-A表達(dá)上調(diào)。
　　 (3)給藥無畸形MSCs移植組VEGF-A和PDGF-A mRNA表達(dá)水平與給藥無畸形組比較無明顯差異,無統(tǒng)計學(xué)意義,說明通過MSCs移植對無畸形胎鼠無明顯治療作用。