胚胎期和生后不同脊髓微環(huán)境對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化影響及RNAi沉默CRMP-4對(duì)先天性脊柱裂治療的研究.pdf

1、目的:
　　神經(jīng)管畸形(Neural tube defects，NTDs)是最常見、最嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)先天性畸形，發(fā)生率為0.5‰-20‰。目前神經(jīng)管畸形在治療方面尚無突破性進(jìn)展。腦積水、下肢功能障礙以及尿便失禁是嚴(yán)重的術(shù)后神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，這主要是由于神經(jīng)損傷后修復(fù)極其困難造成的。隨著干細(xì)胞研究的不斷深入，為神經(jīng)系統(tǒng)損傷的修復(fù)與重建帶來了美好的應(yīng)用前景。在個(gè)體發(fā)育過程中，各種類型的神經(jīng)細(xì)胞是通過多向分化潛能干細(xì)胞逐漸分化而來，這

2、一分化過程受到細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的調(diào)節(jié)。脊髓微環(huán)境是一個(gè)復(fù)雜的綜合系統(tǒng)，其中各種細(xì)胞因子以及細(xì)胞外信號(hào)系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞的遷移分化有著重要作用。因此，本研究建立在胚胎期和出生后不同時(shí)期移植MSCs的動(dòng)物模型，比較不同脊髓微環(huán)境中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化率變化情況，并進(jìn)一步探討不同因子（神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和生長(zhǎng)因子等）在不同脊髓微環(huán)境中表達(dá)規(guī)律及其對(duì)MSCs分化的影響，探討不同脊髓微環(huán)境對(duì)干細(xì)胞分化的影響機(jī)制，為建立神經(jīng)管畸形治療新方法提供前期基礎(chǔ)。
　

3、　我們前期研究發(fā)現(xiàn)在先天性脊柱裂鼠的體內(nèi)移植的MSCs，雖然可以存活，但細(xì)胞成活率較低。因此，我們?cè)O(shè)想可能在先天性脊柱裂鼠脊髓微環(huán)境中存在一些有害因子，這些有害因子不僅能夠引起脊髓本身的神經(jīng)細(xì)胞死亡而導(dǎo)致脊髓發(fā)育不良，而且能夠引起移植干細(xì)胞死亡而導(dǎo)致成活率較低。我們利用雙向電泳和質(zhì)譜分析的方法，對(duì)先天性脊柱裂鼠的局部脊髓組織和相應(yīng)階段的正常脊髓組織的蛋白質(zhì)表達(dá)譜進(jìn)行了對(duì)比分析，首次發(fā)現(xiàn)CRMP-4在先天性脊柱裂鼠的脊髓組織中存在異常高表

4、達(dá)。CRMPs(Collapsin response mediator proteins)家族是近年來新發(fā)現(xiàn)的參與神經(jīng)元細(xì)胞極化和突起生長(zhǎng)的重要分子，已引起人們的高度重視。有研究證明CRMP-4的高表達(dá)與神經(jīng)元凋亡有關(guān)。病理狀態(tài)下CRMP-4異常高表達(dá)是引起神經(jīng)元死亡，并最終導(dǎo)致神經(jīng)損傷修復(fù)困難的主要原因。因此，應(yīng)用CRMP-4 RNAi病毒載體治療先天性脊柱裂，可以減少脊髓組織本身的神經(jīng)元凋亡并促進(jìn)突觸再生，同時(shí)改善脊髓的微環(huán)境，為先

5、天性脊柱裂胎兒提供一種針對(duì)病因治療的新方法。
　　方法:
　　1、間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)分離培養(yǎng)及腺病毒-eGFP轉(zhuǎn)染
　　取體重100g的Wistar大鼠，無菌條件下取股骨，用20ml含10％胎牛血清的培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，制作骨髓細(xì)胞懸液，應(yīng)用全骨髓貼壁法分離骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，5％CO2，37℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
　　綠色熒光蛋白標(biāo)記骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，轉(zhuǎn)染腺

6、病毒-5F35-enhanced GeneFluorescent Protein(eGFP)，16h后熒光顯微鏡下確定綠色熒光蛋白表達(dá)情況，計(jì)數(shù)eGFP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。
　　2、動(dòng)物模型建立及標(biāo)本收集
　　成熟未孕Wistar大鼠雌雄比例5∶1午夜合籠，次日晨8-9時(shí)陰道涂片，顯微鏡下見到精子記為孕0天(Embryonic day0，E0)。
　　移植MSCs及脊髓標(biāo)本收集:利用胎仔外科和顯微注射相結(jié)合技術(shù)建立動(dòng)物模型，胚

7、胎期:在Wistar孕鼠妊娠第16天，麻醉后，進(jìn)行胎鼠顯微外科手術(shù)，對(duì)3-5只胚胎進(jìn)行腰骶段脊髓內(nèi)注射轉(zhuǎn)染eGFP的MSCs。在顯微鏡下打開子宮壁，暴露胎鼠腰骶段脊髓，用微量注射器將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞緩慢注入胎鼠脊髓組織內(nèi)，然后分層縫合子宮壁和腹壁，待孕鼠清醒后放回籠內(nèi)喂養(yǎng)。出生后:分別在Wistar鼠出生后1天，21天時(shí)進(jìn)行MSCs移植。將鼠麻醉后，固定在鼠板上，以棘突為中心取背部后正中切口，顯露脊髓組織后，用微量注射器將轉(zhuǎn)染eGFP的

8、MSCs緩慢注入新生鼠的脊髓組織內(nèi)，逐層縫合，待鼠清醒后放回籠內(nèi)喂養(yǎng)。對(duì)照組應(yīng)用同樣方法給予同等劑量的培養(yǎng)基。在移植后4天取材，4％多聚甲醛固定或取出胎鼠脊髓，-80℃保存。
　　不同發(fā)育階段脊髓標(biāo)本收集:解剖顯微鏡下分別于E12，E14，E16，E18，E20，P1，P3，P5，P7，P14，P21取出鼠脊髓，-80℃保存。
　　3、細(xì)胞分化的免疫熒光染色分析
　　連續(xù)冰凍切片，并計(jì)數(shù)移植的MSCs存活數(shù)量及分布情況

9、。應(yīng)用免疫熒光染色方法檢測(cè)移植的MSCs分化情況，將冰凍切片置于甲醇中二次固定，進(jìn)行抗原修復(fù)，10％血清封閉，加一抗、4℃過夜，加羅丹明或488標(biāo)記的熒光二抗，DAPI染核。鏡下觀察，激光共聚焦顯微鏡采集結(jié)果圖像，分析移植的MSCs表達(dá)Nestin、GFAP、Tublin的情況。
　　4、熒光定量PCR檢測(cè)移植MSCs后和不同發(fā)育階段正常脊髓組織中神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和生長(zhǎng)因子的表達(dá)。
　　提取脊髓組織中的總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄為cD

10、NA，然后進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)。調(diào)整cDNA濃度為500ng/μl，20μl反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為:Stage1預(yù)變性:95℃-30sec; Stage2 PCR反應(yīng):95℃-5sec，60℃-30sec，40個(gè)循環(huán);Stage3融解曲線分析:95℃-10sec，60℃-15sec，95℃-20sec。每個(gè)樣本行3個(gè)平行孔重復(fù)實(shí)驗(yàn)，采用2-△△Ct的方法分析目的基因的相對(duì)表達(dá)量。
　　5、CRMP-4 RNAi載體篩選

11、、構(gòu)建及干擾效果驗(yàn)證
　　通過http://genecopoeia.biomart.cn網(wǎng)站設(shè)計(jì)大鼠CRMP-4的shRNA序列，并構(gòu)建質(zhì)粒載體。將構(gòu)建的4種質(zhì)粒載體分別轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的大鼠神經(jīng)干細(xì)胞，然后利用Westen-blot的方法，篩選出干擾效果最好的質(zhì)粒載體。
　　構(gòu)建CRMP-4 RNAi腺病毒載體，轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的原代培養(yǎng)的大鼠神經(jīng)于細(xì)胞，然后利用熒光定量PCR、Western-blot的方法，在體內(nèi)外驗(yàn)證干擾效果

12、。
　　提取脊髓組織中的總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)。調(diào)整cDNA濃度為500ng/μl，20μl反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為:Stage1預(yù)變性:95℃-30sec; Stage2 PCR反應(yīng):95℃-5sec，60℃-30sec，40個(gè)循環(huán);Stage3融解曲線分析:95℃-10sec，60℃-15sec，95℃-20sec。每個(gè)樣本行3個(gè)平行孔重復(fù)實(shí)驗(yàn)，采用2-△△Ct的方法分析目的基因的相

13、對(duì)表達(dá)量。
　　取50μg蛋白的樣品溶液上樣，恒流電泳15mA/膠，2小時(shí);將電泳后的膠按照8層濾紙-PVDF膜-凝膠-8層濾紙順序制作轉(zhuǎn)膜三明治，恒流1mA/cm2，1小時(shí)轉(zhuǎn)膜;將PVDF膜常溫封閉2小時(shí);加一抗，4℃過夜;加二抗，室溫2小時(shí);ECL顯示條帶，采集圖像并分析。
　　6、脊柱裂模型制作，胎仔外科和顯微外科相結(jié)合進(jìn)行CRMP-4RNAi腺病毒載體治療
　　孕鼠E10時(shí)經(jīng)胃管灌入維甲酸（150mg/kg，橄

14、欖油將atRA溶解成40mg/ml的混懸液）。E16時(shí)將孕鼠麻醉，打開腹腔，暴露子宮，在顯微鏡下打開子宮壁，然后利用顯微注射器將CRMP-4 RNAi腺病毒載體注射入先天性脊柱裂胎鼠的脊髓缺損部位（注入量:0.5μl），對(duì)照組應(yīng)用同種方法注射同等劑量的eGFP腺病毒載體，逐層關(guān)腹，待孕鼠麻醉清醒后放回籠內(nèi)喂養(yǎng)。于移植后4天取材，-80℃保存。
　　結(jié)果:
　　1、細(xì)胞分離培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染情況
　　經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定全骨髓細(xì)胞懸

15、液貼壁法分離培養(yǎng)的MSCs，其純度達(dá)90％以上，eGFP轉(zhuǎn)染率達(dá)70％。
　　2、胎鼠及出生后鼠的存活情況
　　本研究成功建立動(dòng)物模型，進(jìn)行顯微外科手術(shù)，繼續(xù)喂養(yǎng)4天后取材，熒光顯微鏡下可見MSCs在不同發(fā)育階段脊髓組織中均有存活。顯微注射MSCs胎鼠(E16)共102只，術(shù)后存活并得到脊髓標(biāo)本的胎鼠共86只，存活率84％。出生后1天顯微注射MSCs新生鼠82只，術(shù)后存活并得到脊髓標(biāo)本的鼠共68只，存活率82.9％。出生后2

16、1天顯微注射MSCs新生鼠54只，術(shù)后存活并得到脊髓標(biāo)本的鼠共49只，存活率90.7％。
　　3、細(xì)胞分化免疫熒光染色結(jié)果
　　不同發(fā)育階段脊髓中移植的MSCs均有存活，并可分化為不同的神經(jīng)細(xì)胞，移植的MSCs表達(dá)神經(jīng)特異性標(biāo)記物nestin(神經(jīng)前體細(xì)胞)、GPAP(神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞)及tubulin(神經(jīng)元)。胚胎期移植的MSCs分化率明顯高于出生后1天和21天(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、不同發(fā)育階段

17、的脊髓微環(huán)境中移植MSCs存活并分化為神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，并且胚胎期移植的MSCs的分化率明顯高于出生后。
　　2、移植MSCs后，不同發(fā)育階段的脊髓微環(huán)境中神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和生長(zhǎng)因子明顯升高，同時(shí)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和生長(zhǎng)因子的表達(dá)量與MSCs的數(shù)量成正相關(guān)。
　　3、不同發(fā)育階段的脊髓微環(huán)境中神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和生長(zhǎng)因子的表達(dá)量不同，胚胎期脊髓微環(huán)境更有利于MSCs存活和分化為神經(jīng)細(xì)胞。
　　4、成功構(gòu)建CRMP-4