FITC及Gd-DTPA標(biāo)記的可活化穿膜肽在人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞中的作用研究.pdf

1、目的：通過利用可活化穿膜肽的特性將熒光標(biāo)記物及磁共振對(duì)比劑帶入人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞，借此研究肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞在膽管病中的變化，探討在肝膽管病中體外監(jiān)測(cè)膽管上皮細(xì)胞變化及藥物靶向定位的可行性，為臨床上治療膽管病以新的思路，提高膽管病的治療效果。
　　方法：
　　一、穿膜肽的合成及標(biāo)記：可活化穿膜肽（EEEEEEEE-PLGLAG-RRRRRRRR-Ahx-k）由上海淘普生物科技有限公司利用用固相法化學(xué)合成，并在其N端分別標(biāo)記FI

2、TC及Gd-DTPA。
　　二、熒光顯微鏡分析：培養(yǎng)正常人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞（human intrahepatic bile duct epithelial cells，hIBDEC），培養(yǎng)成功后分別用含有2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml的LPS的培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后再將每組分別用25umol?L-1、50umol?L-1、100umol?L-1、150umol?L-1標(biāo)記有FITC的A

3、CPP(FITC-ACPP)孵育2h，觀察上訴各組細(xì)胞及無ACPP孵育有LPS刺激24h有FITC共孵育2h組與無LPS刺激有FITC-ACPP共孵育2h組內(nèi)的熒光表達(dá)情況，選擇出LPS的刺激濃度范圍及最佳的FITC-ACPP作用濃度。
　　三、流式細(xì)胞儀檢測(cè)：（1）分別用含有2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml的LPS培養(yǎng)液培養(yǎng)hIBDEC72h，再將其與100umol?L-1的FITC-ACPP共孵育2h。（2）用含

4、有5μg/ml的LPS培養(yǎng)液培養(yǎng)hIBDEC，按24h、48h、72h時(shí)間梯度培養(yǎng)后，再將其與100 umol?L-1的FITC-ACPP共孵育4h。（3）用含有5μg/ml的LPS培養(yǎng)液培養(yǎng)hIBDEC72h，再將其與100umol?L-1的FITC-ACPP按照1h、2h、4h的時(shí)間梯度共孵育，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)上訴各組細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度值。
　　四、磁共振成像研究：（1）分別用含有2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml

5、的LPS培養(yǎng)液培養(yǎng)hIBDEC72h，再將其與100umol?L-1的標(biāo)記有Gd-DTPA的ACPP（Gd-DTPA-ACPP）共孵育2h。（2）用含有5μg/ml的LPS培養(yǎng)液培養(yǎng)hIBDEC，按24h、48h、72h時(shí)間梯度培養(yǎng)后，再將其與100umol?L-1的Gd-DTPA-ACPP共孵育4h。（3）用含有5μg/ml的LPS培養(yǎng)液培養(yǎng)hIBDEC72h，再將其與100umol?L-1的Gd-DTPA-ACPP按照1h、2h、4

6、h的時(shí)間梯度共孵育，采用磁共振成像儀檢測(cè)上訴各組細(xì)胞及空白細(xì)胞組、無LPS刺激有Gd-DTPA-ACPP共孵育4h組細(xì)胞內(nèi)的平均信號(hào)強(qiáng)度值。并采用視覺評(píng)價(jià)法分析各組細(xì)胞內(nèi)的磁共振信號(hào)變化特征。
　　五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。組與組間比較采用單因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
　　結(jié)果：
　　一、熒光顯微鏡檢測(cè)見無ACPP孵育有LPS

7、刺激24h有FITC共孵育2h組及無LPS刺激有FITC-ACPP共孵育2h組細(xì)胞內(nèi)均未見熒光反應(yīng),其余各組均可見熒光反應(yīng)。同一FITC-ACPP濃度孵育及孵育時(shí)間、不同LPS刺激濃度的細(xì)胞相比，10μg/ml、5μg/ml、2μg/ml組熒光肉眼觀無明顯差異。20μg/ml LPS刺激濃度下細(xì)胞不能貼壁，未到24h細(xì)胞碎裂死亡，15μg/ml LPS刺激濃度組雖未碎裂死亡，但僅有少量細(xì)胞存活，F(xiàn)ITC-ACPP孵育后沖洗細(xì)胞爬片時(shí)細(xì)胞

8、脫離載玻片，故20μg/ml與15μg/ml LPS刺激濃度組未能進(jìn)行熒光顯微鏡拍照；同一LPS刺激濃度、不同F(xiàn)ITC-ACPP濃度孵育的細(xì)胞相比，肉眼觀25umol?L-1與50umol?L-1組較100umol?L-1與150umol?L-1弱、100umol?L-1與150umol?L-1組無明顯差異，故選擇100umol?L-1的FITC-ACPP為實(shí)驗(yàn)濃度。
　　二、流式細(xì)胞儀檢測(cè)見：（1）在5μg/ml LPS刺激濃度

9、刺激72h、100umol?L-1的FITC-ACPP共孵育的條件下，隨著FITC-ACPP孵育時(shí)間的增加（1h、2h、4h），平均熒光強(qiáng)度值逐漸增加，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。（2）在5μg/ml LPS刺激濃度刺激、100umol?L-1的FITC-ACPP共孵育4h的條件下，隨著LPS刺激時(shí)間的增加（24h、48h、72h），平均熒光強(qiáng)度值逐漸增加，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。（3）在不同濃度的LPS刺激72h、100u

10、mol?L-1的FITC-ACPP共孵育2h的條件下，隨著LPS濃度的增加（2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml），平均熒光強(qiáng)度值雖有不同，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　三、磁共振成像研究示：（1）在5μg/ml LPS刺激濃度刺激72h、100umol?L-1的Gd-DTPA-ACPP共孵育的條件下，隨著Gd-DTPA-ACPP孵育時(shí)間的增加（1h、2h、4h），平均磁共振信號(hào)強(qiáng)度值逐漸增加，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

11、<0.05），視覺評(píng)價(jià)法亦能發(fā)現(xiàn)隨著Gd-DTPA-ACPP孵育時(shí)間的增加，各組細(xì)胞間的磁共振信號(hào)強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。（2）在5μg/ml LPS刺激濃度刺激、100umol?L-1的Gd-DTPA-ACPP共孵育4h的條件下，隨著LPS刺激時(shí)間的增加（24h、48h、72h），平均磁共振信號(hào)強(qiáng)度值逐漸增加，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），視覺評(píng)價(jià)法亦能發(fā)現(xiàn)隨著Gd-DTPA-ACPP孵育時(shí)間的增加，各組細(xì)胞間的磁共振信號(hào)強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。（3）

12、在不同濃度的LPS刺激72h、100umol?L-1的Gd-DTPA-ACPP共孵育2h的條件下，隨著LPS濃度的增加（2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml），平均磁共振信號(hào)強(qiáng)度值雖有不同，但無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），視覺評(píng)價(jià)法亦未能發(fā)現(xiàn)差異。上訴各組細(xì)胞內(nèi)的磁共振信號(hào)強(qiáng)度值均較空白細(xì)胞組及無LPS刺激有Gd-DTPA-ACPP共孵育4h組強(qiáng)，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：標(biāo)記有FITC及Gd-DT