TA2小鼠乳腺癌發(fā)生相關(guān)基因的篩選及其多器官轉(zhuǎn)移機(jī)制的初步探討.pdf

1、目的：
　　 1.利用基因芯片技術(shù)，檢測荷瘤TA2小鼠自發(fā)性乳腺癌組織及其未發(fā)瘤乳腺組織基因組表達(dá)狀態(tài)，篩選兩種組織間的差異表達(dá)基因，初步確定與TA2小鼠乳腺癌發(fā)生相關(guān)的侯選基因，并進(jìn)一步探討部分基因的異常表達(dá)與TA2小鼠乳腺癌發(fā)生的關(guān)系，為闡明人乳腺癌，尤其是家族性乳腺癌的發(fā)生機(jī)制提供一定的理論依據(jù)。
　　 2.初步探討趨化因子CXCL12及其受體CXCR4、整合素α4、αL及β2、L-選擇素的表達(dá)與TA2小鼠乳腺癌多

2、器官轉(zhuǎn)移的關(guān)系，為臨床評估乳腺癌轉(zhuǎn)移潛能和發(fā)現(xiàn)抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.利用Affymetrix Mouse Genome4302.0基因表達(dá)譜芯片檢測乳腺癌荷瘤TA2小鼠的腫瘤組織及其未發(fā)瘤乳腺組織的基因組表達(dá)情況，選用MAS5.0、Array2BIO及BGX三種軟件分別篩選這兩種組織間的差異表達(dá)基因。通過比較三種軟件篩選基因的異同，確定應(yīng)用單一軟件分析篩選差異表達(dá)基因時(shí)的適當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)。

3、利用PubMed數(shù)據(jù)庫及Gene Ontology基因注釋初步確定三種方法共同篩選出的差異表達(dá)基因與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。
　　 2.選取三種方法共同篩選出的與腫瘤發(fā)生有關(guān)的部分基因進(jìn)行后續(xù)驗(yàn)證。本研究選擇了印跡基因：DCN、癌基因EGFR和Cyclin D1。利用Real-time PCR和免疫組織化學(xué)方法分別從mRNA和蛋白水平檢測5-6月齡TA2小鼠正常乳腺組織（A組）、乳腺癌荷瘤。TA2小鼠未發(fā)瘤乳腺組織（B組）及腫瘤組

4、織（C組）中上述三個(gè)基因的表達(dá)情況。
　　 3.收集本研究室保存的高轉(zhuǎn)移性（可發(fā)生多器官轉(zhuǎn)移，A組）、低轉(zhuǎn)移性（無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或僅發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，B組）TA2小鼠乳腺癌及A組肺、肝和脾轉(zhuǎn)移瘤標(biāo)本，利用免疫組化方法檢測原發(fā)瘤及轉(zhuǎn)移瘤組織中CXCR4、SDF-1、L-選擇素及整合素α4、αL和β2的表達(dá)情況，利用Real-time PCR檢測不同轉(zhuǎn)移能力的原發(fā)瘤組織中這些分子的mRNA相對表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：
　　 1.

5、基因芯片檢測結(jié)果
　　 1）MAS5.0分析軟件篩選出了3416個(gè)差異表達(dá)基因（P<0.0025），其中1681個(gè)基因在腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)；Array2BIO分析軟件篩選出了661個(gè)差異表達(dá)基因（P<0.01），其中217個(gè)基因在腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)；BGX分析軟件篩選出了2456個(gè)差異表達(dá)基因，其中1104個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，這2456個(gè)基因的差異表達(dá)分布圖包括Ⅰ型分布圖420個(gè)、Ⅱ型分布圖646個(gè)、Ⅲ型分布圖1390個(gè)，Rank介

6、于24.01～385.02，三種類型分布圖的Rank上限在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型分布圖間依次降低。
　　 2）MAS5.0、Array2BIO和BGX三種軟件共同篩選出的基因有260個(gè)，分別占各自篩選的基因總數(shù)的7.61％、39.33％和10.59％。Array2BIO和MAS5.0分析時(shí)以P<0.00015為標(biāo)準(zhǔn)，兩種軟件可分別篩選出94.23％和95.00％的三種軟件共有基因，而候選基因數(shù)目分別減少了10.59％和21.60％。BGX

7、分析結(jié)果顯示：BGX分布圖包括Ⅰ型分布圖170個(gè)，Ⅱ型分布圖74個(gè)，Ⅲ型分布圖16個(gè)，分布圖的構(gòu)成比與BGX單獨(dú)分析時(shí)明顯不同（x2=368.29，P<0.0001），主要為Ⅰ型和Ⅱ型分布圖，選取具有Ⅰ型和Ⅱ型分布圖的基因可使候選基因數(shù)目減少56.60％。這260個(gè)共有基因中，60.38％的異常表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、預(yù)后或治療有關(guān)，其中與人乳腺癌或小鼠乳腺腫瘤有關(guān)的基因有68個(gè)。
　　 2.DCN、EGFR、Cycl

8、in D1及PCNA在正常乳腺及乳腺癌組織中的表達(dá)
　　 1）免疫組化染色結(jié)果顯示：DCN高表達(dá)率在A組（50％）顯著高于B組（17.86％）（P<0.05）：B組EGFR高表達(dá)率和核陽性表達(dá)率均顯著高于A組（x2=7.56，20.49；P<0.01），并且高表達(dá)率顯著高于C組（x2=4.38；P<0.05）；B組和C組中Cyclin D1標(biāo)記指數(shù)在EGFR核陽性表達(dá)者均顯著高于核陰性表達(dá)者（Z=-2.28，-2.07，P<0.

9、05），兩組EGFR核陽性表達(dá)水平均與Cyclin D1標(biāo)記指數(shù)呈顯著正相關(guān)（rs=0.723，0.474，P<0.05），PCNA的表達(dá)與EGFR是否存在核表達(dá)無關(guān)。
　　 2）Real-time PCR結(jié)果顯示：DCN mRNA相對表達(dá)水平在A組最高（0.95±0.25），在C組最低（0.13±0.10），A、B、C三組間呈遞減趨勢（P<0.05）：EGFR mRNA相對表達(dá)水平在B組最高（0.05±0.02），在A組最低（

10、0.02±0.01），B組顯著高于A組和C組（P<0.05）；Cyelin D1 mRNA相對表達(dá)水平在C組最高（0.42±0.22），在A組最低（0.04±0.01），A、B、C三組間呈遞增趨勢（P<0.001）；PCNA在B組表達(dá)水平最高（0.38±0.24），在A組最低（0.14±0.10），B組顯著高于A組和C組（P<0.05）。
　　 3.高轉(zhuǎn)移性TA2小鼠乳腺癌的特征
　　 本研究室收集的7例高轉(zhuǎn)移性乳腺癌的

11、高轉(zhuǎn)移特性存在差異，部分腫瘤在體內(nèi)傳代時(shí)逐漸喪失高轉(zhuǎn)移能力。具有穩(wěn)定的高轉(zhuǎn)移特性的腫瘤乳腺原位接種時(shí)移植瘤生長緩慢，接種瘤細(xì)胞后3w即可在肺及脾出現(xiàn)肉眼明顯可見的轉(zhuǎn)移瘤，而肝鏡下可見多發(fā)微轉(zhuǎn)移瘤。7例原發(fā)瘤及其轉(zhuǎn)移瘤中均觀察到了血管生成擬態(tài)，血管生成擬態(tài)的陽性率明顯高于低轉(zhuǎn)移性乳腺癌（P<0.05）。
　　 4.CXCR4、CXCL12、L-選擇素及整合素4、αL和β2在高轉(zhuǎn)移性（A組）和低轉(zhuǎn)移性（B組）TA2小鼠乳腺癌及A組肺

12、、肝和脾轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)
　　 1）免疫組化結(jié)果顯示：A組和B組原發(fā)腫瘤組織中CXCL12、L-選擇素、整合素αL的平均陽性細(xì)胞百分比分別約55.49％VS.33.13％、39.81％VS.16.75％、24.81％VS.10.47％，三種分子在A組中的表達(dá)均顯著高于B組（Z=-2.41，-2.14，-2.31；P<0.05），而CXCR4、整合素α4和β2的表達(dá)在A組與B組間無明顯差別；轉(zhuǎn)移瘤與原發(fā)瘤相比僅L-選擇素的平均陽性細(xì)

13、胞百分比在肝轉(zhuǎn)移灶中顯著高于原發(fā)瘤（Z=-2.24，P=0.025），而CXCR4、CXCL12、整合素α4、αL、β2平均陽性細(xì)胞百分比在轉(zhuǎn)移瘤與原發(fā)瘤間差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且整合素αL和CXCR4在部分轉(zhuǎn)移灶中呈陰性表達(dá)。
　　 2）Real-time PCR結(jié)果顯示：原發(fā)腫瘤組織L-選擇素、整合素αL mRNA相對表達(dá)水平在A組顯著高于B組（Z=-3.32，-3.47，P=0.001），而整合素α4和β2mRNA相對表達(dá)

14、水平在兩組間無明顯差異。
　　 結(jié)論：
　　 1.多種軟件聯(lián)合分析或單一軟件分析Affymetrix基因表達(dá)譜芯片時(shí)采用不同的判定標(biāo)準(zhǔn)均可顯著縮小侯選基因的范圍，可以提高后續(xù)驗(yàn)證的準(zhǔn)確性，盡管此方法有可能丟失部分與腫瘤發(fā)生有關(guān)的基因。
　　 2.TA2小鼠乳腺組織中DCN表達(dá)水平隨鼠齡增長逐漸降低，而EGFR表達(dá)卻逐漸升高，并且出現(xiàn)了核表達(dá)。核表達(dá)的EGFR可通過上調(diào)Cyclin D1的表達(dá)使部分上皮細(xì)胞呈現(xiàn)高增

15、殖能力。乳腺組織中DCN、EGFR、Cyclin D1的異常表達(dá)是中老年TA2小鼠乳腺上皮細(xì)胞具有高增殖活性的原因之一，可能與其乳腺癌發(fā)生有關(guān)。
　　 3.TA2小鼠乳腺癌細(xì)胞的高轉(zhuǎn)移能力并不穩(wěn)定，存在減退現(xiàn)象。趨化因子及其受體（CXCL12/CXCR4）、淋巴細(xì)胞歸巢有關(guān)分子（L-選擇素、整合素α4、αL和β2）中僅L-選擇素的表達(dá)可能與其肝轉(zhuǎn)移有關(guān)，這些分子的表達(dá)并不是高轉(zhuǎn)移性TA2小鼠乳腺癌多器官轉(zhuǎn)移的主要原因。乳腺癌細(xì)胞