干燥綜合征唇腺cDNA差減文庫(kù)的構(gòu)建和異常表達(dá)基因的篩選及其功能的初探.pdf

1、通過(guò)構(gòu)建干燥綜合征(Sjōgren’s syndrome，SS)患者唇腺組織cDNA差減文庫(kù)，篩選SS患者唇腺中異常表達(dá)的基因，從中選擇若干可能與SS發(fā)病機(jī)制相關(guān)的基因作為研究對(duì)象，從mRNA水平、蛋白質(zhì)水平進(jìn)行研究，并結(jié)合臨床檢驗(yàn)指標(biāo)進(jìn)行分析，初步探討這些基因在疾病發(fā)生、發(fā)展中的作用。 研究對(duì)象 唇腺組織全部來(lái)自2004年9月～2006年4月間在北京協(xié)和醫(yī)院口腔粘膜科接受唇腺活檢的患者。分原發(fā)SS和正常對(duì)照兩組，原發(fā)S

2、S的入選標(biāo)準(zhǔn)要符合2002年SS國(guó)際分類(診斷)標(biāo)準(zhǔn)，除外同時(shí)合并其它結(jié)締組織病的患者。對(duì)照組選擇標(biāo)準(zhǔn)是：有口干或眼干主訴，但SFR和眼科濾紙實(shí)驗(yàn)檢測(cè)均正常，自身抗體陰性，唇腺病理正常，同時(shí)除外合并其它基礎(chǔ)病變。另外還包括部分唇腺囊腫患者或下唇外傷的患者，收集病變組織周圍或清創(chuàng)組織中的正常唇腺作為研究材料，除外伴發(fā)其它全身疾病的患者。兩實(shí)驗(yàn)組間的年齡比較經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)無(wú)顯著性差異。 所有參與本實(shí)驗(yàn)的患者在進(jìn)行唇腺活檢前均被告知，活

3、檢取出的唇腺除送病理科行常規(guī)檢查外，還將有部分唇腺樣本用于SS發(fā)病機(jī)制的基礎(chǔ)研究，獲得研究對(duì)象同意后留取唇腺活檢的部分標(biāo)本用于本次研究。 詳細(xì)記錄參與本實(shí)驗(yàn)患者的臨床資料，包括年齡、性別、SFR、腮腺造影、濾紙實(shí)驗(yàn)、淚膜破裂時(shí)間、角膜染色、ANA、抗SSA抗體、抗SSB抗體、RF、免疫球蛋白(Ig)、ESR、唇腺活檢病理等。 方法 1．SS唇腺組織中cDNA差減文庫(kù)的構(gòu)建：利用TRIR(Total RNA Iso

4、lation Reagent，ABgene)分別提取SS和正常對(duì)照唇腺中總RNA，利用差減PCR試劑盒(Clontech PCR-Select<'TM> cDNA Subtraction Kit，Clontech)進(jìn)行差減雜交，將雜交產(chǎn)物轉(zhuǎn)入載體，構(gòu)建正、反兩個(gè)差減文庫(kù)。 2．異常表達(dá)基因的篩選：隨機(jī)挑選768個(gè)克隆與核素([α-<'32>P]-dATP)標(biāo)記的PCR第二輪產(chǎn)物進(jìn)行雜交，進(jìn)行Northern blot驗(yàn)證，選擇雜

5、交信號(hào)Ratio值大于2的克隆進(jìn)行測(cè)序，所用引物為SP6和T7(Seqtlenase V2．OKit，UK)，在ABI377測(cè)序儀(美國(guó)Perkin-Elmer公司產(chǎn)品)單向測(cè)序，將得到的序列在www.ncbi.nlm.nih.gov網(wǎng)上進(jìn)行比對(duì)，得到GeneBank號(hào)和基因名稱等有關(guān)信息，查閱文獻(xiàn)，選擇與SS發(fā)病可能有關(guān)的基因做為研究的目標(biāo)基因。 3．目標(biāo)基因的mRNA定量分析：根據(jù)目標(biāo)基因的序列設(shè)計(jì)特異性引物，同時(shí)合成內(nèi)參基

6、因的引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物電泳后掃膠進(jìn)行半定量分析。 4．蛋白質(zhì)表達(dá)的免疫組化分析：用中性福爾馬林固定，石蠟包埋的唇腺切片做底物，用山羊抗人MUC5B親合純化多克隆抗體(Santa Cruz)進(jìn)行免疫組化染色，使用Image-Pro plus5.0病理圖像分析軟件測(cè)定視野內(nèi)棕色顆粒沉積的累計(jì)光密度，以此代表蛋白表達(dá)量。 5．觀測(cè)結(jié)果建立Excel數(shù)據(jù)庫(kù)，使用SPSS11.0(Statistics Pakag

7、e forSocial Science)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，比較SS組和正常對(duì)照組間的差異，將目標(biāo)基因的mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平與臨床檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析，P小于0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 1．SS組和正常對(duì)照組患者年齡比較，經(jīng)過(guò)t檢驗(yàn)，p>0.05，沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明這兩組人群在年齡方面存在可比性。 2．成功構(gòu)建SS唇腺cDNA的差減文庫(kù)，隨機(jī)挑選768個(gè)克隆，經(jīng)Northern blot驗(yàn)證R

8、atio值大于2的有99個(gè)克隆，其中上調(diào)51個(gè)，下調(diào)48個(gè)，經(jīng)過(guò)測(cè)序得到63個(gè)200-700bp的序列片斷，上網(wǎng)比對(duì)，與GenBank已收錄的基因符合率在98％以上。 3．經(jīng)過(guò)半定量PCR分析，MUC5B和MUC7基因在兩組間的表達(dá)存在顯著性差異，t值分別為2.4和2.3，P值分別0.032和0.021，說(shuō)明這兩個(gè)基因在SS患者唇腺中表達(dá)明顯低于正常對(duì)照。 4.MLJC5B和MLJC7 mRNA的表達(dá)量分別與病程、SFR

9、、Ig γ％、ESR、RF、唇腺中淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)灶評(píng)分(LFS)、抗SSA抗體滴度進(jìn)行相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)SS患者唇腺中這兩個(gè)基因表達(dá)量與LFS和抗SSA抗體滴度呈顯著負(fù)相關(guān)，MLJC5B與這兩個(gè)因素的Pearson相關(guān)系數(shù)分別為-0.387和-0.474，P值分別為0.032和0.013；mJC7與這兩個(gè)因素的Pearson相關(guān)系數(shù)分別為-0.386和-0.595，P值分別為0.032和0.001。多元回歸分析證實(shí)這兩個(gè)基因表達(dá)量只與抗SSA

10、抗體滴度相關(guān)，MUC5B和MUC7的回歸系數(shù)分別為-0.714和-0.708，P值分別為0.001。 5.UC5B免疫組化分析：MUC5B主要分布在腺泡細(xì)胞上，導(dǎo)管細(xì)胞少量著色，說(shuō)明該蛋白主要由腺泡細(xì)胞表達(dá)。SS患者唇腺中MUC5B蛋白的表達(dá)明顯低于正常對(duì)照。 6.MUC5B蛋白表達(dá)量分別與病程、SFR、球蛋白γ％、ESR、RF、唇腺中LFS、抗SSA抗體滴度進(jìn)行相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)SS患者唇腺中蛋白表達(dá)量與LFS、抗SSA抗

11、體滴度呈顯著負(fù)相關(guān)，與MUC5B mRNA表達(dá)量呈正相關(guān)，Pearson相關(guān)系數(shù)分別為-0.3396，-0.546和0.750，P值分別為0.041，0.003和0.000。多元回歸分析證實(shí)只有MUC5B mRNA表達(dá)水平與蛋白表達(dá)水平相關(guān)，回歸系數(shù)別113.664，P值為0.000。 結(jié)論 1.抑制性差減雜交方法可用于風(fēng)濕病發(fā)病機(jī)制的研究，是初步高通量篩選異常表達(dá)基因的用力手段。 2.成功構(gòu)建了SS患者唇腺cD

12、NA差減文庫(kù)，SS患者唇腺中存在異常表達(dá)的基因。利用差減文庫(kù)篩選出來(lái)的基因部分可能與SS發(fā)病相關(guān)，可以作為目標(biāo)基因進(jìn)一步研究。 3.MIJC5B和MIJC7mRNA的表達(dá)在SS患者唇腺組織中是明顯低于正常對(duì)照。與疾病的活動(dòng)性無(wú)關(guān)，主要與抗SSA抗體滴度相關(guān)，提示自身抗體在其中起主要作用。 4.MUC5B和MUC7的基因表達(dá)的變化同步，影響表達(dá)變化的因素相同，提示可能是同一機(jī)制導(dǎo)致兩種基因表達(dá)的變化。 5.MUC5