文昌魚神經(jīng)胚差減文庫構(gòu)建和兩個胚胎發(fā)育相關(guān)基因的表達研究.pdf

1、文昌魚在進化上占據(jù)重要的地位，它身體構(gòu)造簡單，皮膚和胚胎透明，肉眼即可觀察到內(nèi)部的發(fā)育情況，而且它基本軀體構(gòu)成與脊椎動物相同，因此一直以來都是脊椎動物起源進化和發(fā)育機制研究的理想的模式動物。在文昌魚胚胎發(fā)育的過程中，神經(jīng)胚是一個非常關(guān)鍵的時期，涉及到許多重要器官的形成和組織分化，尤其是神經(jīng)管的形成和體節(jié)的出現(xiàn)。
　　 為了篩選在這一胚胎發(fā)育階段中起到重要調(diào)控作用的基因，我們應(yīng)用抑制性差減雜交技術(shù)構(gòu)建了白氏文昌魚(Branchio

2、stoma belcheri)神經(jīng)胚差減文庫，測序得到的204個EST序列去掉重復(fù)序列后進行拼接，得到了82個單獨的拼接體。序列比對分析發(fā)現(xiàn)82個拼接體中56％與其它物種中的已知基因同源，其余的44％與已知基因沒有明顯的相似性，將其暫定為未鑒定基因。用RTqPCR對這些基因在原腸胚和神經(jīng)胚中的差異表達進行驗證，結(jié)果顯示70％在神經(jīng)胚階段呈現(xiàn)高表達。進一步對未鑒定基因進行詳細的序列分析，發(fā)現(xiàn)其中3個在佛羅里達文昌魚中存在同源基因，但在其它

3、物種中未發(fā)現(xiàn)有同源基因存在，因此認為它們是文昌魚特有的基因。對這些特有基因進行深入的研究將會為文昌魚神經(jīng)胚發(fā)育的研究工作提供更多有價值的資料。
　　 在神經(jīng)胚差減文庫中，我們篩選到了一個脊椎動物FABP基因的同源基因-AmphiFABP，進一步應(yīng)用RACE PCR擴增了該基因的cDNA全序列，并對其在不同發(fā)育時期胚胎中的表達情況進行了研究，以期弄清其與脊椎動物FABP基因家族的關(guān)系。系統(tǒng)進化分析表明，該基因是脊椎動物中6個FAB

4、P家族成員(H-FABP、B-FABP、E-FABP、M-FABP、A-FABP和T-FABP)共同的祖先基因。RTqPCR和原位雜交分析結(jié)果表明，在文昌魚神經(jīng)胚早期，AmphiFABP基因的表達量遠高于其它時期，其表達部位主要集中在背部的神經(jīng)外胚層和體節(jié)中，說明AmphiFABP基因與文昌魚的神經(jīng)管形成和體節(jié)出現(xiàn)相關(guān)。
　　 此外，我們還擴增了神經(jīng)胚差減庫中發(fā)現(xiàn)的文昌魚AmphiN57基因的全長cDNA，佛羅里達文昌魚基因組的

5、搜索結(jié)果顯示，除AmphiN57外，文昌魚中還有另外兩個與AmphiN57高度相似的基因Bf N57L和Bf N57L2，以上三種基因的蛋白都含有2個EF-hand(EFh)結(jié)構(gòu)域，屬于EFh鈣結(jié)合蛋白超家族的成員。同源性分析發(fā)現(xiàn)，其它物種中不存在AmphiN57等三種基因的直系同源基因，只有NCS蛋白家族某些成員的EFh結(jié)構(gòu)域與AmphiN57等三種蛋白有較低的相似性(小于20％)，結(jié)合序列比對和系統(tǒng)進化樹的結(jié)果，推測以上三個基因由N

6、CS家族成員倍增后特化形成，它們共同組成NCS基因家族在文昌魚中特有的一個亞家族。時空表達分析發(fā)現(xiàn)，AmphiN57基因特異的在原腸胚和神經(jīng)胚階段表達，神經(jīng)胚階段其表達量急劇增加，且在中胚層、內(nèi)胚層和神經(jīng)外胚層都有表達，由此推測該基因可能對胚胎發(fā)育過程中的神經(jīng)系統(tǒng)形成和胚層分化具有重要的調(diào)控作用。
　　 本研究還以日本文昌魚(Branchiostoma japonicum)性腺cDNA為材料構(gòu)建了文昌魚雌雄性腺的差減cDNA文庫

7、。正向差減雜交以卵巢為試驗方、精巢為驅(qū)動方，反向差減雜交以精巢為試驗方、卵巢為驅(qū)動方，最后獲得的正、反向差減文庫分別含459、243個重組子。PCR擴增鑒定正、反向差減cDNA文庫的插入片段，其中90％左右的克隆皆能擴增出有效產(chǎn)物，插入片段范圍為200-600 bp，符合差減文庫PCR產(chǎn)物片段的大小。隨機選取30個陽性克隆測序分析，得到26個有效基因片段，進一步從中選取16個序列，用RTqPCR對文庫質(zhì)量進行驗證，結(jié)果表明所建文庫能夠達