大白豬和清平豬分娩啟動過程中miRNA表達分析和miR-144功能研究.pdf

1、分娩啟動是一個非常復(fù)雜的生理過程，通過激活炎癥反應(yīng)和一系列生物化學(xué)事件而引起激素變化，其機制尚未研究清楚。近年來的研究發(fā)現(xiàn)miRNA參與分娩啟動時子宮肌層收縮和孕酮(Progestone，P4)代謝。因此，本研究旨在闡明miRNA調(diào)控分娩啟動的分子機制。我們分別提取妊娠114d有分娩征兆的大白豬(LL)、妊娠111 d有分娩征兆的清平豬(QS)、妊娠114d有分娩征兆的清平豬(QL)和妊娠111d沒有分娩征兆的大白豬(LN)胎盤組織的總

2、RNA，分別構(gòu)建兩個豬種不同妊娠期胎盤組織的小RNA文庫，運用高通量測序技術(shù)獲得miRNA表達譜。將LL、QS和QL的miRNA表達譜分別與LN的miRNA表達譜對比，獲得差異表達miRNA，預(yù)測其潛在靶基因，運用GO功能注釋靶基因，從中篩選與分娩啟動相關(guān)的miRNA。以篩選出的與分娩啟動相關(guān)的miR-144為研究對象，探究其在分娩啟動過程中的作用。本課題主要研究結(jié)果如下:
　　1.在清平豬和大白豬的胎盤中，通過Illumina測

3、序獲得12組原始序列，原始序列在4，131，656條到5，687，285條之間。每個樣本的clean reads占原始序列的60％～93％，建庫質(zhì)量較好。
　　2.通過edgeR軟件分析LL、 QS和QL與LN的miRNA表達譜，獲得三組差異表達miRNA。結(jié)果顯示與LN胎盤相比，在LL胎盤中發(fā)現(xiàn)9個上調(diào)和10個下調(diào)的miRNA，miR-144在LL中上調(diào)表達，并且有研究報道其調(diào)控前列腺素(Prostaglandin，PG)的分泌

4、;在QL胎盤中發(fā)現(xiàn)13個上調(diào)和10個下調(diào)的miRNA;在QS胎盤中發(fā)現(xiàn)14個上調(diào)和7個下調(diào)的miRNA。
　　3.預(yù)測三組差異表達miRNA潛在靶基因，GO分析靶基因。結(jié)果顯示其主要富集到與激素刺激響應(yīng)相關(guān)的生物學(xué)過程。KEGG分析顯示，大多數(shù)基因富集到與炎癥響應(yīng)和激素代謝有關(guān)的通路。
　　4.運用Cytoscape軟件構(gòu)建LL/LN中miRNA與節(jié)點mRNA的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果顯示，ssc-miR-345-5p和ssc-miR

5、-326靶向HNF4A、Fos和SMAD3基因，ssc-miR-193a-3p、ssc-miR-664-3p和ssc-miR-122靶向SMAD3基因，為分娩啟動研究提供新的思路。
　　5.分析妊娠15.5d和18.5d小鼠羊膜組織,發(fā)現(xiàn)在妊娠18.5d時miR-144、 Fos和COX2(cyclooxygenase2)的表達顯著上調(diào)，PGE2的分泌增加。運用脂多糖(LPS)構(gòu)建小鼠早產(chǎn)模型，分析表明，LPS顯著增加miR-14

6、4、Fos和COX2基因的表達水平。表明在分娩和早產(chǎn)中miR-144、Fos和COX2基因可能發(fā)揮作用。
　　6.利用轉(zhuǎn)錄因子Fos超表達載體轉(zhuǎn)染人羊膜上皮(WISH)細胞，分析發(fā)現(xiàn)，miR-144、Fos和COX2顯著上調(diào)表達。通過構(gòu)建miR-144啟動子分段缺失的pGL3熒光載體，發(fā)現(xiàn)pGL3-promoter-700熒光活性最高。通過構(gòu)建轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合突變的熒光載體、EMSA和ChIP分析驗證在miR-144啟動子區(qū)存在3處轉(zhuǎn)

7、錄因子Fos的結(jié)合位點。
　　7.利用miR-144 mimics分別與Fos3'UTR和COX23'UTR的primGLO載體共轉(zhuǎn)染Hela細胞，證明miR-144顯著抑制primGLO-Fos3'UTR和primGLO-COX23'UTR載體的雙熒光素酶活性。在WISH細胞中轉(zhuǎn)染miR-144mimics,表明miR-144顯著降低Fos和COX2的表達水平，顯著抑制PGE2的分泌。在WISH細胞中共轉(zhuǎn)染miR-144mimi

8、cs/COX2靶標保護劑/Fos靶標保護劑，Western blot分析發(fā)現(xiàn)COX2蛋白水平高于對照組，表明miR-144可以通過Fos間接靶向COX2。在WISH細胞中，轉(zhuǎn)染Fos過表達/Fos靶標保護劑/COX2靶標保護劑，結(jié)果表明，添加COX2保護劑能夠顯著上調(diào)COX2蛋白的表達，上調(diào)PGE2的分泌，表明伴隨著Fos上調(diào)表達，miR-144能部分抑制COX2蛋白的表達。
　　8.懷孕15.5d的小鼠注射雌激素(Estroge

9、n，E2)，模擬分娩。注射E2能夠顯著上調(diào)羊膜中miR-144、Fos和COX2的表達。WISH細胞中添加10nM E2，結(jié)果與小鼠羊膜一致。
　　結(jié)論:(1)通過高通量測序分析分娩啟動時大白豬和清平豬胎盤組織的小RNA文庫，獲得大白豬和清平豬分娩啟動時miRNA表達譜，從轉(zhuǎn)錄組水平系統(tǒng)地闡述了激素調(diào)控、免疫和炎癥反應(yīng)等生物學(xué)過程是分娩啟動的分子基礎(chǔ)。(2)進一步的研究結(jié)果表明，在懷孕小鼠羊膜和人羊膜細胞中Fos、COX2和miR