奶牛泌乳啟動過程乳腺組織基因和蛋白表達(dá)研究.pdf

1、奶牛泌乳發(fā)動包括兩個階段。第Ⅰ階段開始于產(chǎn)前數(shù)周，特征為乳腺組織分化并逐步出現(xiàn)分泌活動;第Ⅱ階段自分娩至產(chǎn)后數(shù)天，特征為腺泡細(xì)胞緊密連接關(guān)閉并開始分泌初乳和乳汁。
　　 為研究泌乳發(fā)動分子過程，首先用數(shù)字基因表達(dá)譜技術(shù)在轉(zhuǎn)錄水平上分析并比較了產(chǎn)前35天(-35 d)、產(chǎn)前7天(-7d)和產(chǎn)后3天(+3d)乳腺組織基因表達(dá)情況。建立的三個乳腺組織cDNA庫（-35d、-7d和+3d），分別包含6.2、5.8和6.1百萬個21-nt

2、 cDNA標(biāo)簽，經(jīng)與參考基因標(biāo)簽比對，三個cDNA庫分別含有8662、8363和8359個基因。以|log2Ratio|≥1，F(xiàn)DR≤0.001為標(biāo)準(zhǔn)，比較三個時間點乳腺組織基因差異表達(dá)情況。-7d與-35d乳腺組織比較（Ⅰ階段），共有812個基因差異表達(dá)，占到-7d乳腺組織cDNA庫基因總數(shù)的9.7％。其中表達(dá)上調(diào)基因234個，表達(dá)下調(diào)基因578個，分別占到差異表達(dá)基因總數(shù)的28.8％和71.2％。表達(dá)上調(diào)基因主要參與細(xì)胞周期，有絲分

3、裂，以及固醇、脂類代謝等過程，表達(dá)下調(diào)基因主要是參與免疫反應(yīng)，生物粘附等過程。+3d與-7d乳腺組織比較（Ⅱ階段），共有1189個基因差異表達(dá)，占到+3d乳腺組織cDNA庫表達(dá)基因總數(shù)的14.2％。其中表達(dá)上調(diào)基因274個，表達(dá)下調(diào)基因915個，分別占到差異表達(dá)基因總數(shù)的23.0％和77.0％。表達(dá)上調(diào)基因主要是參與免疫反應(yīng)等過程，表達(dá)下調(diào)基因主要是參與細(xì)胞周期等過程。泌乳啟動兩個階段連續(xù)上調(diào)表達(dá)的基因11個，主要是乳蛋白基因，連續(xù)下調(diào)

4、表達(dá)的基因17個。在第Ⅰ階段上調(diào)、第Ⅱ階段下調(diào)的基因共111個，它們主要是參與細(xì)胞周期等過程;在第Ⅰ階段下調(diào)、第Ⅱ階段上調(diào)的基因92個，主要是參與免疫反應(yīng)等過程的基因。為了驗證DGE結(jié)果的準(zhǔn)確性，隨機選取了13個基因，用熒光定量PCR方法測定了它們在泌乳啟動過程的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)結(jié)果與DGE結(jié)果一致。在轉(zhuǎn)錄水平的研究結(jié)果表明泌乳發(fā)動是通過增強細(xì)胞增殖，合成代謝，以及抑制免疫反應(yīng)，細(xì)胞外基質(zhì)基因表達(dá)實現(xiàn)的。
　　 其次用同位素標(biāo)記相

5、對和絕對定量技術(shù)（iTRAQ）分析了泌乳啟動兩個階段的蛋白表達(dá)情況。共鑒定出2271種蛋白，其中80％蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量在100kDa以內(nèi)。按照蛋白差異倍數(shù)＞1.2倍，P值≤0.05的判斷標(biāo)準(zhǔn)，產(chǎn)前7天與產(chǎn)前35天相比（泌乳啟動Ⅰ階段），差異表達(dá)蛋白共373個，其中包括多種乳蛋白和免疫球蛋白，并且糖酵解相關(guān)酶蛋白表達(dá)降低，三羧酸循環(huán)相關(guān)酶蛋白表達(dá)升高。這些差異表達(dá)蛋白參與的生物學(xué)過程主要包括生物合成，細(xì)胞組分合成，和核苷酸代謝過程等。

6、產(chǎn)后3天與產(chǎn)前7天相比，共有273個差異表達(dá)蛋白，它們參與的生物學(xué)過程主要是調(diào)控各種生物學(xué)過程，如調(diào)控生物合成過程和代謝過程。
　　 將蛋白組與轉(zhuǎn)錄組進行關(guān)聯(lián)分析。產(chǎn)前7天與產(chǎn)前35天相比，差異蛋白和差異基因的關(guān)聯(lián)系數(shù)r為0.6983，大于0，即正相關(guān)，轉(zhuǎn)錄水平越高，蛋白表達(dá)也越多。還有329個基因只在蛋白水平差異表達(dá)，轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有差異，GO分析結(jié)果表明這些基因參與的生物學(xué)過程主要包括翻譯，葡萄糖代謝，和電子傳遞鏈等。產(chǎn)后3天與

7、產(chǎn)前7天相比，差異蛋白和差異基因的關(guān)聯(lián)系數(shù)r為0.5509，大于0，也為正相關(guān)。只在蛋白水平差異表達(dá)，轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有差異的基因共223個，GO分析發(fā)現(xiàn)這類基因參與的生物學(xué)過程主要包括翻譯和免疫反應(yīng)等。
　　 總之，奶牛泌乳啟動Ⅰ階段，即產(chǎn)前7天與產(chǎn)前35天相比，乳腺細(xì)胞增殖，部分乳蛋白和免疫球蛋白表達(dá)上調(diào)，檸檬酸循環(huán)相關(guān)酶蛋白表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞外基質(zhì)減少，免疫相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)，糖酵解相關(guān)酶蛋白表達(dá)下調(diào)。產(chǎn)后3天與產(chǎn)前7天相比，免疫相關(guān)