大鼠煙曲霉菌性角膜炎動物模型的建立及其免疫病理的研究.pdf

1、目的： 建立大鼠煙曲霉菌性角膜炎動物模型。探討煙曲霉菌感染角膜組織后角膜局部的免疫病理機(jī)制。 方法： 刮除大鼠角膜上皮層，以右眼為實(shí)驗(yàn)眼，在角膜面與自制角膜接觸鏡之間直接涂抹培養(yǎng)的菌落或滴加不同濃度的孢子懸液；以左眼為對照眼，在角膜面與自制角膜接觸鏡之間滴加無菌生理鹽水。觀察病程，行角膜病理切片HE和PAS染色，比較得出較好的建模方法，對病程進(jìn)行合理分期。采用該方法建立實(shí)驗(yàn)早期、中期、后期組及對照組。實(shí)驗(yàn)組分別于

2、接種后2天(d)、6d、2周(W)時處死取標(biāo)本，對照組于接種后3d處死取標(biāo)本。采用免疫組織化學(xué)方法觀察角膜組織中中性粒細(xì)胞、LC、T淋巴細(xì)胞(CD3<'+>T)及其亞群CD4<'+>T、CD8<'+>T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞的動態(tài)變化。采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)，檢測IL-6、IL-10、細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)在不同病程角膜組織中的表達(dá)。 結(jié)果： 菌落直接涂抹法能穩(wěn)定且簡便的建立大鼠煙曲霉菌性角膜

3、炎動物模型。在大鼠煙曲霉菌性角膜炎早期(接種后1-3d)，見角膜水腫、角膜白色潰瘍浸潤灶形成，PAS染色見菌絲平行或斜形生長于角膜基質(zhì)前1/3層。免疫組化見多量中性粒細(xì)胞及少量CD3<'+>T、CD4<'+>T、CD8<'+>T淋巴細(xì)胞和LC浸潤，未檢測到B淋巴細(xì)胞。在中期(接種后4-7d)，角膜黃白潰瘍、干燥致密。PAS染色見菌絲潰瘍灶位于角膜基質(zhì)前1/3-2/3層，周圍被大量炎癥細(xì)胞包圍，中性粒細(xì)胞浸潤達(dá)高峰。免疫組化見T淋巴細(xì)胞浸

4、潤增加，其中CD4<'+>T淋巴細(xì)胞多于CD8<'+>T淋巴細(xì)胞。LC亦增多，B淋巴細(xì)胞開始出現(xiàn)。在晚期(接種后9-14d)，角膜白斑及大量新生血管長入。病理切片見肉芽腫樣改變，PAS染色未見菌絲或孢子。免疫組化見中性粒細(xì)胞數(shù)目有所減少，T淋巴細(xì)胞浸潤達(dá)高峰，CD4<'+>T淋巴細(xì)胞亦多于CD8<'+>T淋巴細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞少量表達(dá)。對照組角膜IL-6、IL-10、ICAM-1幾乎不表達(dá)或極微量表達(dá)。在實(shí)驗(yàn)組角膜中，IL-6早期即大量表

5、達(dá)，中期炎癥反應(yīng)高峰時亦達(dá)高峰，以后逐漸下降；IL-10在早期表達(dá)最高以后逐漸下降；ICAM-1早期開始表達(dá)中期達(dá)高峰以后逐漸下降。lL-6在晚期組與對照組間無差別(p>0.05)，余早期組、中期組、對照組問均有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01)。IL-10、ICAM-1在實(shí)驗(yàn)對照組與實(shí)驗(yàn)組早、中、晚期組四組間均有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01)。 結(jié)論： (1)菌落直接涂抹法是建立大鼠煙曲霉菌性角膜炎動物模型較好的方法。 (