熱缺血再灌注損傷影響肝臟細(xì)胞周期調(diào)控基因的表達(dá)譜聚類分析及相關(guān)蛋白研究.pdf

1、隨著器官移植療效的提高，病例數(shù)逐年遞增，移植器官短缺日趨嚴(yán)重。在劈裂式肝移植、活體肝移植尚不成熟，異種移植、轉(zhuǎn)基因動物仍未取得實質(zhì)性進(jìn)展之前，“邊緣”供體受到越來越多的重視。在我國供肝大多來自無心跳“邊緣’’供體，供肝切取時熱缺血再灌注損傷無法避免；另外，移植物恢復(fù)血流后膽道的溫缺血亦值得關(guān)注。同時熱缺血再灌注損傷也是肝膽外科手術(shù)各種肝門血流阻斷法應(yīng)用下相當(dāng)常見的問題。 觀察肝臟熱缺血再灌注損傷對細(xì)胞周期調(diào)控和組織細(xì)胞再生相關(guān)基

2、因表達(dá)的影響，篩選出與細(xì)胞周期檢查點密切相關(guān)的功能基因及相關(guān)蛋白，以探討熱缺血再灌注損傷的分子機(jī)制；為臨床防治熱缺血再灌注損傷提供實驗依據(jù)。 本實驗采用成組隨機(jī)對照的實驗設(shè)計，利用微陣列芯片和實時熒光定量PCR聯(lián)合分析技術(shù)，分析熱缺血再灌注損傷大鼠模型處理后的基因表達(dá)動態(tài)變化；按基因表達(dá)的動力學(xué)特征對功能基因進(jìn)行多元變量聚類分析。針對目的蛋白Hsp70、Gadd45a，、Egrl、CyclinDl的westernblot半定量實

3、驗和免疫熒光組織化學(xué)進(jìn)行細(xì)胞定位及時序研究。 發(fā)現(xiàn)在常溫?zé)崛毖?0min、再灌注1h和24h時間點，肝實質(zhì)細(xì)胞分別有86、410和234條基因上調(diào)其mRNA表達(dá)，下調(diào)的基因分別為136、312和653條。根據(jù)其表達(dá)動力學(xué)特征繪制出分級聚類分析樹形圖。熒光定量RT-PCR擴(kuò)增分析細(xì)胞保護(hù)機(jī)制密切相關(guān)的基因如：Gadd45a，、Egr1、Hsp70，確認(rèn)實驗結(jié)果與芯片檢測相一致。 Western blot半定量研究顯示Egr1蛋白在

4、熱缺血30m即有高表達(dá)，再灌注30m表達(dá)有所下降。Hsp70蛋白和CyclinD1蛋白在灌注早期保持高表達(dá)狀態(tài)。 免疫熒光染色和western blot蛋白研究方法顯示：Egr1蛋白在熱缺血30m即有高表達(dá)，再灌注30m-1h表達(dá)稍有下降，逐漸下降至處理前水平，符合早期即刻基因的表達(dá)特點。Gadd45a、Hsp70蛋白和CyclinD1蛋白在灌注早期1-3h保持高表達(dá)狀態(tài)。HSP70是細(xì)胞漿陽性，N時陰性，R1h和R2h時有灶性

5、弱陽性，R3h時強(qiáng)陽性，陽性細(xì)胞主要在肝小葉中央靜脈血管周圍；Cyclin D1為核陽性，N時即有部分陽性，R1-R24h的陽性變化不大；Egr-1冰凍切片顯示為核陽性，N時陰性，130'和R30'時均有個別細(xì)胞陽性，R1h和R2h時數(shù)量增多，總體陽性表達(dá)要稍低于Cyclin D1；GADD45為N(一)，其它均為灶性胞漿陽性，只有R1h時胞漿和核均陽性。 顯示在采用非致死性WIRI處理后，再灌注早期肝臟細(xì)胞周期調(diào)控基因相關(guān)基因