新的肝細胞癌相關候選基因IDDO1的克隆和鑒定.pdf

1、為尋找與肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)發(fā)生、發(fā)展相關的新基因,該所于2000年運用抑制性消減雜交(suppression subtractive hybridization,SSH)技術,構建了HCC消減cDNA文庫并獲得了93個克隆,我們挑選其中2條表達序列標簽(expressed sequencetag,EST)P15、P65進行研究.P15、P65的來源背景提示他們與HCC有著密切的關系,而目

2、前尚未發(fā)現P15、P65導致腫瘤發(fā)生、發(fā)展的直接證據.為了驗證這個推測,為HCC尋找新的致病基因、診斷指標和治療靶點,該實驗擬以P15、P65 EST序列為基礎,1、使用半定量逆轉錄PCR(reversetranscriptase-PCR,RT-PCR)方法,對21例HCC標本的肝硬化和HCC組織中P15和P65 mRNA的表達情況進行檢測,排除可能出現的假陽性結果;2、綜合運用生物信息學(Bioinformatics)和cDNA末端快

3、速擴增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技術克隆P1 5、P65的全長cDNA;3、將全長cDNA的開放讀碼框(open reading frame,ORF)克隆入真核表達載體pEGFP-C1,構建重組表達載體,并將此表達載體轉入肝癌細胞系HepG2和正常肝細胞系L02中,觀察P15、P65過表達對肝細胞系生物學行為的影響;4、克隆入原核表達載體,表達ORF編碼蛋白.為早期診斷、治療性試劑的研

4、制打下基礎.結論1、P65是與HCC相關的差異表達基因的表達序列標簽,而P15為假陽性結果.2、生物信息學在正確選擇目標EST、加速克隆新基因方面有其不可替代的作用.3、首次從HCC組織中克隆出HCC相關候選基因IDD01.4、成功構建IDD01的真核報告表達載體pEGFP-ORF/P65.5、IDD01可加重肝癌細胞系HepG2的惡性表型,可增強正常肝細胞系L02的增殖能力,但不能使其發(fā)生惡性轉化.6、成功構建IDD01的原核表達載體