XAGE基因的表達(dá)及其在腫瘤生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移中的功能研究.pdf

1、癌癥是嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病之一，探索診斷和治療癌癥的手段是生物學(xué)研究的重要任務(wù)。轉(zhuǎn)移性和侵襲性是惡性腫瘤的重要特征，與基因和蛋白質(zhì)水平上的一系列改變密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)涎腺腺樣囊性癌(Adenoidcystic carcinoma of salilary gland，SACC)高、低轉(zhuǎn)移細(xì)胞系A(chǔ)CC-M和ACC-2的mRNA表達(dá)譜比較研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，腫瘤睪丸抗原(Cancer/testis antigen，CTAs)家族成員XAG

2、E-1在ACC-M細(xì)胞中有較高表達(dá)現(xiàn)象。用RNA干擾降低ACC-M細(xì)胞中XAGE-1的表達(dá)使得該細(xì)胞在體外和體內(nèi)的轉(zhuǎn)移率下降。該結(jié)果提示XAGE-1可能是一種和ACC腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的CTAs。
　　 已有報(bào)道XAGE-1在尤文肉瘤、黑色素瘤、肺腺癌等腫瘤中有較高表達(dá)；其表達(dá)受到甲基化調(diào)控；在肺癌和前列腺癌患者體內(nèi)能刺激體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答；但功能未知。本論文對(duì)XAGE-1在口腔腫瘤中的表達(dá)及不同剪接體差異表達(dá)機(jī)制，在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)

3、和轉(zhuǎn)移中的作用、機(jī)理和可能的免疫學(xué)應(yīng)用進(jìn)行了研究。
　　 整個(gè)研究分為5個(gè)部分。第一部分利用Real-time PCR和免疫組化(Immunohistochemistry，IHC)方法檢測(cè)了XAGE-1在口腔腫瘤及部分正常組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示XAGE-1四種剪接體在口腔腫瘤中的表達(dá)有較大差異，其中1b表達(dá)量最高，和1d表達(dá)相關(guān)聯(lián)；1a和1c表達(dá)量較低；在ACC腫瘤中有較高水平的表達(dá)；在淋巴結(jié)中天然表達(dá)。
　　 第二部分

4、我們對(duì)XAGE-1上游啟動(dòng)子區(qū)域采用熒光素酶報(bào)告載體，進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄活性分析。結(jié)果顯示，1b轉(zhuǎn)錄本上游片段的轉(zhuǎn)錄活性遠(yuǎn)高于1a上游片段，兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本間隔181bp的一段序列可能是造成1a，1b轉(zhuǎn)錄活性巨大差異的主要原因；并且1b在腫瘤細(xì)胞SPC-A1中的轉(zhuǎn)錄活性要高于正常胚胎細(xì)胞293T；在ACC-M中的轉(zhuǎn)錄活性要高于ACC-2細(xì)胞。對(duì)XAGE-1四種剪接體進(jìn)行亞細(xì)胞定位研究發(fā)現(xiàn)1a，1b，1c都是核內(nèi)定位，1d為全細(xì)胞分布，提示存在XAGE

5、-1特異的核定位信號(hào)。
　　 第三部分中，我們構(gòu)建了真核表達(dá)XAGE-1b的載體，對(duì)該基因影響腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移進(jìn)行了研究。發(fā)現(xiàn)XAGE-1b過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和克隆形成，而XAGE-1b穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)速度也較對(duì)照加快，出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移。穩(wěn)定干擾XAGE-1b的ACC-M細(xì)胞株在體外和裸鼠皮下生長(zhǎng)速度減慢，穿膜能力下降。
　　 第四部分我們檢測(cè)了瞬時(shí)表達(dá)XAGE-1b對(duì)ACC-2細(xì)胞周期、凋亡的影響。

6、發(fā)現(xiàn)XAGE-1b表達(dá)使得ACC-2細(xì)胞周期G0-G1期減少，G2-M增加；也使得ACC-2細(xì)胞對(duì)1250u/ml的TNF-α或者血清饑餓誘導(dǎo)凋亡有一定的耐受作用。用Mercury信號(hào)通路質(zhì)粒系統(tǒng)分析，結(jié)果顯示XAGE-1b表達(dá)對(duì)RB，CRE，C-Myc，HSE，E2F，GRE，NF-κB因子的反應(yīng)元件有不同程度的轉(zhuǎn)錄激活，對(duì)P53，AP1稍有抑制。其中，對(duì)RB(P<0.01)和C-Myc(P<0.05)的激活作用顯著。進(jìn)一步對(duì)C-My

7、c和RB作濃度梯度實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示XAGE-1b對(duì)C-Myc反應(yīng)元件的激活呈較好的線性關(guān)系，表達(dá)質(zhì)粒300ng時(shí)激活作用達(dá)到對(duì)照組的7倍；而對(duì)RB的激活作用較弱，達(dá)到飽和濃度時(shí)為對(duì)照組的2倍。
　　 為了進(jìn)一步弄清ACC-2細(xì)胞的免疫遺傳學(xué)特征，第五部分研究中，我們對(duì)ACC-2細(xì)胞株進(jìn)行了HLA(Human Leukocyte Antigen)分型，確定其HLA型別為HLA-A24/68，B72/72，DR1/1。同時(shí)建立了一種基

8、于融解曲線分析的快速HLA-DR位點(diǎn)熒光分型方法，為后續(xù)XAGE-1的免疫學(xué)研究打下基礎(chǔ)。
　　 綜上所述，本論文發(fā)現(xiàn)XAGE-1基因在包括ACC腫瘤在內(nèi)的口腔腫瘤中有表達(dá)，在淋巴結(jié)中天然表達(dá)；XAGE-1b為優(yōu)勢(shì)轉(zhuǎn)錄本，核定位；證明XAGE-1b具有促進(jìn)ACC腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移作用；并從機(jī)理上提示XAGE-1b可能對(duì)細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等重要信號(hào)通路發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能。以上結(jié)果為XAGE-1相關(guān)腫瘤診斷和治療研究奠定了良好基礎(chǔ)，也