乙型肝炎病毒PreS1單克隆抗體的制備及特性研究.pdf

1、目的：乙型肝炎病毒(HBV)感染危害巨大，慢性乙肝至今仍缺乏有效的治療手段和解決方案，HBV感染機(jī)制的研究進(jìn)展相對(duì)滯后是嚴(yán)重影響新型治療方法和藥物研發(fā)的重要原因之一。PreS1在HBV感染過(guò)程中具有很重要的作用，對(duì)于研究意義重大，但目前缺乏其特異性單克隆抗體，影響了其功能的深入研究。本研究通過(guò)原核表達(dá)純化PreS1蛋白，利用雜交瘤技術(shù)制備PreS1特異性單克隆抗體，為進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。 方法： 1．采用PCR法擴(kuò)增含H

2、indⅢ與Xba Ⅰ酶切位點(diǎn)的 PreS1 基因片段，原核表達(dá)載體pGST-MOLUC及PCR產(chǎn)物經(jīng)雙酶切后，用 T<,4>DNA連接酶將兩者連接并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 JM109 構(gòu)建并篩選重組質(zhì)粒。隨后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析和 Western-blot檢測(cè)。以谷胱甘肽-Sepharose 4B凝膠為填料進(jìn)一步采用親和層析純化融合蛋白。 2．用PreS1

3、 融合蛋白作為抗原免疫Balb/c小鼠，采用雜交瘤技術(shù)，制備抗 PreS1的單克隆抗體，用ELISA方法篩選分泌抗PreS1 單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，采用間接ELISA 方法和Western-blot進(jìn)行McAb特異性鑒定；同時(shí)采用間接ELISA 方法鑒定McAb的Ig亞類(lèi)，檢測(cè)McAb的效價(jià)及相對(duì)親和力，并進(jìn)行McAb結(jié)合表位分析。并對(duì)其染色體進(jìn)行分析。 結(jié)果： 1．采用PCR方法擴(kuò)增得到與預(yù)期大小一致的目的基因片段

4、。重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定及測(cè)序分析證實(shí)重組質(zhì)?？寺〕晒?，命名為pGST-PreS1。轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌后成功誘導(dǎo)出分子量為37kD的GST-PreS1 融合蛋白，與預(yù)期分子量相符，誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白約占總菌蛋白的10％左右。Western-blot檢測(cè)表明誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白能分別與抗GST的單抗和抗PreS1的單抗發(fā)生特異性結(jié)合。采用谷胱甘肽-Sepharose 4B凝膠純化融合蛋白，純化蛋白純度約為90％左右。 2．成功篩選出兩株可分

5、泌特異性McAb的雜交瘤細(xì)胞P1A1和P283，其抗體亞類(lèi)分別為IgG<,2b>，IgG<,3>；將生長(zhǎng)良好的雜交瘤細(xì)胞接種到預(yù)處理的Balb/c 小鼠腹腔中制備腹水型PreS1的單克隆抗體，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)證明腹水效價(jià)可達(dá)10<'-7>；Western-blot 結(jié)果鑒定提示該單克隆抗體可以特異的結(jié)合PreS1。ELISA相加實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示2株McAb識(shí)別不同的抗原表位。 結(jié)論：綜上所述，我們運(yùn)用重組DNA技術(shù)與原