中華鱉虹彩病毒單克隆抗體的制備、特性分析及應(yīng)用研究.pdf

1、以純化的中華鱉虹彩病毒為抗原免疫Balb/C小鼠，經(jīng)細(xì)胞雜交融合、篩選，制備出分泌抗中華鱉虹彩病毒特異性單克隆抗體的細(xì)胞系，分析了中華鱉虹彩病毒單克隆抗體的免疫生物學(xué)特性，建立了能夠用于檢測中華鱉虹彩病毒的ELISA、IFA方法，應(yīng)用中華鱉虹彩病毒單克隆抗體對蛙虹彩病毒屬STIV、RGV、FJIV三株病毒的抗原性進(jìn)行了初步的比較分析。獲得如下結(jié)果： 1、中華鱉虹彩病毒的提取與純化：對中華鱉虹彩病毒的三種不同的純化方法進(jìn)行比較分析

2、，結(jié)果表明兩次凍融后差速離心的方法純化病毒純度差，回收率較低；磁力攪拌加上超聲處理后差速離心可以提高病毒粒子的回收率，但容易造成病毒結(jié)構(gòu)破壞；勻漿、磁力攪拌，差速離心結(jié)合蔗糖密度梯度離心方法可獲得高純度的病毒樣品，電鏡觀察和SDS-PAGE分析進(jìn)一步證實最后一種方法提純的病毒純度高、結(jié)構(gòu)完好，可用于免疫Balb/C鼠。 2、中華鱉虹彩病毒單克隆抗體的制備：以純化的中華鱉虹彩病毒抗原免疫Balb/C小鼠，取免疫小鼠脾細(xì)胞與SP2/

3、0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行雜交融合，經(jīng)過初篩、復(fù)篩和三次有限稀釋法克隆，獲得8個能穩(wěn)定分泌抗中華鱉虹彩病毒特異性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為Mab2A4、Mab8E1、Mab1D3、Mab2H1、Mab3A1、Mab485、Mab5E1和Mab6F2。 3、中華鱉虹彩病毒單克隆抗體免疫生物學(xué)特性分析：單克隆抗體亞級份分析結(jié)果表明，Mab2A4屬IgA，Mab8E1是IgG2a，其他的6株單抗1D3、2H1、3A1、485、5E1和6

4、F2的亞級份均為IgG1。ELISA分析表明，8株單抗均能特異性地識別中華鱉虹彩病毒抗原，與EPC、Co、FHM等宿主細(xì)胞抗原不產(chǎn)生任何交叉反應(yīng)，腹水抗體的ELISA效價在10-4～10-6之間。IFA分析表明，8株單抗中僅Mab5E1沒有免疫熒光反應(yīng)特性，其余7株單抗均能對染毒病灶產(chǎn)生特異性的熒光染色。中和試驗結(jié)果證實8株單抗均沒有中和病毒的特性。Western-blot結(jié)果顯示，Mab1D3和Mab2A4分別識別分子量為84kDa和

5、35kDa中華鱉虹彩病毒結(jié)構(gòu)蛋白，Mab3A1能夠同時識別分子量分別為14kDa、15kDa和16kDa的三條多肽，其余單抗不具備Western-blot反應(yīng)特性。這些結(jié)果提示上述單抗對中華鱉虹彩病毒抗原高度特異、靈敏，可用于中華鱉虹彩病毒的檢測和結(jié)構(gòu)蛋白分析。 4、單克隆抗體在虹彩病毒研究中的應(yīng)用：應(yīng)用中華鱉虹彩病毒單克隆抗體對蛙病毒屬的STIV、RGV、FJIV三株病毒進(jìn)行交叉反應(yīng)，結(jié)果表明8株單抗與三種不同來源的蛙病毒抗原

6、均有ELISA反應(yīng)特性，除了Mab5E1外，其余單抗與三種不同來源的蛙病毒抗原均有IFA反應(yīng)特性。結(jié)果表明蛙病毒屬的STIV、RGV、FJIV三株病毒抗原性高度一致，可能提示蛙病毒屬屬特異性抗原位點高度保守。 虹彩病毒結(jié)構(gòu)復(fù)雜，揭示虹彩病毒的致病和免疫機(jī)理難度大。中華鱉虹彩病毒單克隆抗體的成功制備為分析蛙病毒屬病毒的結(jié)構(gòu)蛋白與功能，病毒復(fù)制、裝配，以及侵染宿主和康復(fù)過程病毒粒子的分布與消長提供了十分有用的工具，并奠定重要的技術(shù)基