痰瘀互結(jié)證冠心病模型的病理機(jī)制及方證相應(yīng)基礎(chǔ)研究.pdf

1、本文在前期疾病模型研究和臨床研究的基礎(chǔ)上,首次利用復(fù)合方法在小型豬體內(nèi)建立病證結(jié)合的痰瘀互結(jié)證冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(簡(jiǎn)稱冠心病,下同)模型；運(yùn)用冠狀動(dòng)脈造影結(jié)合血管內(nèi)超聲以及虛擬組織成像等技術(shù),觀察冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的演變過(guò)程；從內(nèi)皮組織損傷、冠脈血管斑塊穩(wěn)定性到差異蛋白質(zhì)表達(dá)、細(xì)胞死亡模式等多層面、多指標(biāo)研究冠心病疾病模型的病理機(jī)制,揭示痰瘀互結(jié)證候的演化過(guò)程。同時(shí)選用經(jīng)典方藥對(duì)病證結(jié)合模型進(jìn)行治療,初步探討方證相應(yīng)理論的規(guī)律與本質(zhì)

2、,并對(duì)模型的可靠性及病理演化過(guò)程進(jìn)行反證。
　　 1.痰瘀互結(jié)證冠心病小型豬模型的建立
　　 材料與方法
　　 選用中國(guó)實(shí)驗(yàn)小型豬(Chinese experimental miniature swine,CEMS)隨機(jī)分為4組:(1)正常對(duì)照組(Con):普通飼料,不拉傷冠脈血管,n=8；(2)血瘀阻脈證候模型組(YY):單純冠脈拉傷,n=6；(3)痰濁壅盛證候模型組(TT):單純高脂飼料,n=6；(4)痰瘀互

3、結(jié)證候模型組(TY):冠脈拉傷+高脂飼料,n=6。對(duì)于TY模型而言,高脂飼料喂養(yǎng)2周后,小型豬冠脈行球囊過(guò)擴(kuò)張3次,每次30s,并輕微拉動(dòng)球囊2次。手術(shù)結(jié)束后,連續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)8周(week,w)。其他實(shí)驗(yàn)方法見附表(第14頁(yè),supplementary table)。
　　 結(jié)論
　　 三種不同的造模方法(YY,TT,TY)對(duì)小型豬心肌缺血過(guò)程中一般情況、血管活性物質(zhì)釋放、缺血反應(yīng)以及冠脈的改變均有不同程度的影響,但僅

4、復(fù)合方法(TY)對(duì)上述主要指標(biāo)均有明顯的作用,說(shuō)明復(fù)合因素模型綜合單純冠脈損傷(YY)和單純高脂飼料喂養(yǎng)(TT)兩種技術(shù)優(yōu)勢(shì),符合痰瘀互結(jié)的病證結(jié)合理論,也有助于解釋中醫(yī)證候?qū)W說(shuō)的科學(xué)內(nèi)涵。本研究分別對(duì)胸痹心痛的主癥、兼癥、舌象及舌下脈絡(luò)和脈象進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化評(píng)分和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。這種在動(dòng)物體內(nèi)模擬中醫(yī)臨床過(guò)程的研究方法,通過(guò)對(duì)動(dòng)物自身信息特征的挖掘,將有利于推動(dòng)病證結(jié)合模型研究的發(fā)展。
　　 2痰瘀互結(jié)證冠心病病理演化過(guò)程研究
　

5、　 材料與方法
　　 36只中國(guó)實(shí)驗(yàn)小型豬,隨機(jī)分為6組,每組6只:(1)正常對(duì)照組(Con):普通飼料,不拉傷冠脈血管；(2)2w+6h模型組(Model-2w+6h):高脂飼料喂養(yǎng)2w+冠脈拉傷后6h；(3)3w模型組(Model-3w):高脂飼料喂養(yǎng)2w+冠脈拉傷后1w；(4)4w模型組(Model-4w):高脂飼料喂養(yǎng)2w+冠脈拉傷后2w；(5)6w模型組(Model-6w):高脂飼料喂養(yǎng)2w+冠脈拉傷后4w；(6)1

6、0w模型組(Model-10w):高脂飼料喂養(yǎng)2w+冠脈拉傷后8w。其余實(shí)驗(yàn)方法同前。
　　 結(jié)論
　　 本文從血液流變學(xué)、內(nèi)皮組織損傷和冠脈血管病理生理指標(biāo)入手,結(jié)合傳統(tǒng)中醫(yī)證候研究方法,通過(guò)連續(xù)、綜合因素、多指標(biāo)觀察證候模型的研究,揭示痰瘀互結(jié)證候的演化過(guò)程。在此過(guò)程中,血脂異常為始動(dòng)因素,進(jìn)而導(dǎo)致血液流變學(xué)異常；內(nèi)皮細(xì)胞破壞,導(dǎo)致血管舒縮功能下降,在炎性介質(zhì)的參與下血管受損處逐漸出現(xiàn)脂質(zhì)沉積,引發(fā)心肌缺血表現(xiàn),最終

7、可影響心臟的收縮功能。
　　 3小型豬冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的IVUS-VH研究
　　 方法
　　 行冠脈造影后,將超聲導(dǎo)絲置入冠狀動(dòng)脈LAD中下部,手動(dòng)回撤IVUS導(dǎo)管,觀察受損血管的程度和受累血管的長(zhǎng)度。再次進(jìn)入IVUs導(dǎo)管,進(jìn)行圖像采集和記錄。IVUS-VH數(shù)據(jù)存儲(chǔ)于硬盤,實(shí)驗(yàn)完成后進(jìn)行分析。斑塊的邊界利用灰階(Grey scale)圖像獲得。VH軟件自動(dòng)分析斑塊的構(gòu)成和對(duì)應(yīng)的比例。
　　 結(jié)論
　

8、　 冠脈損傷后隨著高脂飲食時(shí)間的延長(zhǎng),動(dòng)脈粥樣硬化斑塊逐漸發(fā)展,壞死和鈣化斑塊的比例升高提示斑塊的穩(wěn)定性降低；IVUS-VH對(duì)于小型豬冠脈特點(diǎn)的分析與血管組織學(xué)的吻合度較好。
　　 4痰瘀互結(jié)證冠心病模型小型豬血清蛋白組學(xué)研究
　　 方法
　　 應(yīng)用雙向凝膠電泳(2-DE)、基質(zhì)輔助激光解析-飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)等先進(jìn)的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)方法,對(duì)正常和痰瘀互結(jié)證冠心病模型動(dòng)物的血清進(jìn)行蛋白提取、

9、分離及鑒定。
　　 正常對(duì)照組(Con,n=30)和模型組(Model,n=30)血清樣品經(jīng)處理備用,WCX磁珠經(jīng)預(yù)處理,制備蛋白芯片,用SELDI-TOF-MS進(jìn)行檢測(cè)芯片,BiomarkerWizard version3.1軟件處理蛋白峰并進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。
　　 結(jié)論
　　 小型豬動(dòng)脈粥樣硬化模型與正常動(dòng)物的血清蛋白質(zhì)組差異明顯；鑒定出的C4BP、apoE等差異蛋白功能特性與痰瘀互結(jié)證冠心病免疫調(diào)控、脂質(zhì)代謝、

10、急慢性炎癥反應(yīng)等過(guò)程密切相關(guān)；篩選到的M/Z8634可以作為血清生物學(xué)標(biāo)志物,用以區(qū)分模型組和正常對(duì)照組動(dòng)物血清。
　　 5小型豬心肌缺血后細(xì)胞死亡模式研究
　　 方法
　　 心肌病理組織學(xué)觀察細(xì)胞壞死,纖維增生；利用電鏡技術(shù)觀察心肌細(xì)胞、毛細(xì)血管形態(tài)及雙層膜包繞的自噬小體的形成；Western Blotting檢測(cè)Beclin1(哺乳動(dòng)物自噬的標(biāo)記蛋白,參與自噬體膜的形成)、LC3(微管相關(guān)蛋白1輕鏈3,MAP

11、1LC3)蛋白表達(dá):免疫組化法檢測(cè)Cathepsin B、D和Caspase-3、9的表達(dá)；通過(guò)Caspase-3活力檢測(cè)及Tunel染色(FITC)觀察細(xì)胞凋亡的情況。
　　 結(jié)論
　　 冠脈損傷最終可導(dǎo)致心肌血流供應(yīng)障礙,壞死、凋亡及自噬均可發(fā)生,而且共同作用引起心肌細(xì)胞的缺失。掌握自噬作用與細(xì)胞凋亡、壞死的相互關(guān)系,有助于發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)和策略。
　　 6痰瘀互結(jié)證冠心病方證相應(yīng)的探索性研究
　　

12、材料與方法
　　 36只中國(guó)實(shí)驗(yàn)小型豬,隨機(jī)分為6組,每組6只:(1)正常對(duì)照組(Con):普通飼料,不拉傷冠脈血管；(2)模型組(Model):冠脈拉傷+高脂飼料；(3)西藥對(duì)照組(XY):辛伐他汀0.5mg/kg；(4)化痰組(HT):瓜蔞薤白半夏湯6g生藥/kg；(5)祛瘀組(QY):血府逐瘀湯8g生藥/kg:(6)痰瘀同治組(TY):瓜蔞薤白半夏湯3g生藥/kg合血府逐瘀湯4g生藥/kg。冠脈拉傷后第2天開始給藥,同時(shí)繼

13、續(xù)喂養(yǎng)高脂飼料,持續(xù)8周。
　　 結(jié)論
　　 在改善BMI和血脂增加方面,化痰法具有較好的治療作用,而單獨(dú)祛瘀法和痰瘀同治法作用較差；痰瘀互結(jié)證病理過(guò)程中的血管活性因子和炎性因子釋放、血流動(dòng)力學(xué)改變和冠脈狹窄等是痰瘀同治方的作用靶點(diǎn),因此痰瘀同治可以更好地體現(xiàn)方證相應(yīng)的治療原則,取得最佳療效。
　　 綜上所述,本文在建立痰瘀互結(jié)冠心病病證結(jié)合的小型豬動(dòng)物模型基礎(chǔ)上,探索其病理機(jī)制。利用傳統(tǒng)方藥進(jìn)行干預(yù),探討方證相

14、應(yīng)理論的規(guī)律與本質(zhì),并對(duì)模型建立的可靠性及病理演化過(guò)程進(jìn)行驗(yàn)證。特異的蛋白質(zhì)表達(dá)模式和心肌細(xì)胞死亡模式的研究則有助于尋找基本的生物學(xué)標(biāo)志物及藥物干預(yù)的新靶點(diǎn)。本文的創(chuàng)新性主要有如下幾點(diǎn):
　　 1.采用高脂飼料喂養(yǎng)結(jié)合冠脈內(nèi)皮損傷復(fù)合方式,在實(shí)驗(yàn)小型豬體內(nèi)建立了新的痰瘀互結(jié)證冠心病病證結(jié)合的動(dòng)物模型；
　　 2.引入并初步建立病證結(jié)合動(dòng)物模型的擬臨床評(píng)價(jià)方法,從血液流變學(xué)、血管活性物質(zhì)釋放、炎性因子激活、冠脈內(nèi)皮異常等方