鞘氨醇激酶-1的乙酰化修飾及在糖尿病防治中的作用研究.pdf

1、鞘氨醇激酶1（SphingosineKinase1）SPK1是鞘磷脂代謝中的關鍵酶，參與了多種細胞生命活動。對SPK1的蛋白序列進行分析發(fā)現(xiàn)，其N-端含有一個保守的GKGK結構域，該結構域出現(xiàn)在多種發(fā)生乙酰化修飾的蛋白序列中，是一個公認的乙?；揎椊Y構域，其中的K是發(fā)生乙?；揎椀奈稽c。據(jù)此，推斷SPK1可能發(fā)生乙?；揎?。首先，將Flag-SPK1轉染到HEK293細胞，用Flag-M2珠子將SPK1沉淀下來，用抗ace-Lys抗體雜

2、交，檢測到乙?；腟PK1。其次，沉淀產(chǎn)物與p300及乙酰CoA共同孵育后用抗ace-Lys抗體雜交，結果顯示p300能增強SPK1的乙?；Ｒ陨辖Y果說明SPK1是一個乙?；揎椀鞍?，可被p300乙?；?。將SPK1蛋白GKGK結構域中的兩個K均突變?yōu)镽或Q，并轉染HEK293細胞，經(jīng)G418篩選后獲得穩(wěn)定表達野生型W-SPK1及突變體R-SPK1、Q-SPK1蛋白的細胞系。我們發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定表達W-SPK1的細胞檢測到SPK1蛋白的乙酰化，而

3、R-SPK1沒有檢測到乙?；?，揭示SPK1乙?；l(fā)生在其GK結構域的K上。
　　SPK1蛋白的這種翻譯后修飾可能是其蛋白功能的一種重要的調控方式。實驗結果表明，SPK1乙?；揎椇笃浞€(wěn)定性增強；將GKGK結構域中的兩個K突變?yōu)镽或Q，封閉了SPK1的泛素化修飾，避免了被蛋白酶體降解。細胞形態(tài)上，穩(wěn)定表達Q-SPK1的細胞與表達W-SPK1及R-SPK1的細胞相比體積變大，但細胞生長速度變慢；流式分析細胞周期發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定表達Q-SPK

4、1的細胞處于S期的細胞明顯增多，G2期的則減少，表明Q-SPK1阻斷細胞由S期向G2/M期的進程。綜上，SPK1乙酰化在調控細胞生長、大小及細胞周期中有重要作用。
　　在體外實驗基礎上，以自發(fā)性2型糖尿病KK/Ay小鼠為動物模型，灌胃給予攜帶野生型及突變體spk1基因的減毒沙門氏菌，在動物整體水平評價SPK1乙酰化修飾對糖尿病動物血糖的調節(jié)作用。結果顯示，口服攜帶Q-SPK1質粒的減毒沙門氏菌可以降低2型糖尿病小鼠KK/Ay的血糖