HarPinx蛋白的純化、抗體制備及轉(zhuǎn)hrfx基因棉花的研究.pdf

1、Harpin蛋白是由植物病原細(xì)菌產(chǎn)生的富含甘氨酸，對(duì)熱穩(wěn)定但對(duì)蛋白酶K敏感的一類(lèi)蛋白。它在非寄主植物上能夠引起過(guò)敏反應(yīng)，而且很可能是植物病原細(xì)菌的一個(gè)重要的致病因子。另外，harpin蛋白還能夠誘導(dǎo)植物產(chǎn)生病蟲(chóng)抗性以及提高作物的產(chǎn)量與品質(zhì)。
　　 本研究中，作者根據(jù)GeneBank已經(jīng)登錄的序列設(shè)計(jì)引物，利用PCR技術(shù)分別從水稻黃單胞兩個(gè)致病變種的基因組DNA擴(kuò)增到它們的harpin蛋白編碼基因，即：水稻白葉枯病菌（Xantho

2、monas.oryzae pv.oryzae）JxoⅢ的harpinXoo蛋白編碼基因hrf1和水稻細(xì)條斑病菌（X.oryzae pv.oryzicola）Rs105的harpinXooc蛋白編碼基因hrf2。將hrf1和hrf2克隆至pGEM-T Easy載體經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證無(wú)誤后分別克隆至pGEX-EF載體，構(gòu)建了表達(dá)融合蛋白GST-harpinx的原核表達(dá)載體pGEX-hrf1和pGEX-hrf2。研究表明，融合蛋白GST-harpin

3、X表達(dá)菌株BL21/pGEX-hrf1和BL21/pGEX-hrf2在0.1 mM IPTG、28℃誘導(dǎo)4 h的條件下都能夠很好地表達(dá)融合蛋白GST-harpinX，且主要以可溶形式存在。沒(méi)有誘導(dǎo)劑IPTG存在的情況下，融合蛋白GST-harpinX不表達(dá)，表明融合蛋白GST-harpinX是誘導(dǎo)表達(dá)的，而繼續(xù)提高誘導(dǎo)劑IPTG的濃度和延長(zhǎng)誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)融合蛋白GST-harpinx的表達(dá)量影響不大。37℃誘導(dǎo)時(shí)，融合蛋白GST-harpi

4、nXooc表達(dá)產(chǎn)物仍主要以可溶形式存在，與28℃誘導(dǎo)時(shí)比較沒(méi)有明顯變化，而融合蛋白GST-harpinXoo的表達(dá)產(chǎn)物則主要以不溶的包涵體形式存在于細(xì)胞超聲破碎后的沉淀中。
　　 利用Bulk GST Purification Module和Thrombin Cleavage Capture Kit兩個(gè)試劑盒對(duì)harpinX進(jìn)行了純化。每升誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞可收獲純化harpinX蛋白≥6 mg，純化蛋白的濃度達(dá)到了1.5～2.0 m

5、g/ml。GST-harpinX融合蛋白和harpinX純化蛋白均能夠在非寄主植物煙草上引起過(guò)敏反應(yīng)。由于在純harpinX時(shí)作者采用了沸水浴的步驟，因此純化的harpinX蛋白具有很好的熱穩(wěn)定性；但GST-harpinX融合蛋白沸水浴處理后，再進(jìn)行SDS-PAEG分析時(shí)，已找不到相應(yīng)條帶，說(shuō)明harpinX與GST的融合破壞了它的熱穩(wěn)定性。
　　 用純化蛋白harpinX免疫新西蘭大白兔制備了抗血清，抗harpinXoo血清的

6、效價(jià)可達(dá)1:3000以上，而抗harpinXooc血清的效價(jià)可達(dá)1:6000以上。采用蛋白A柱層析法純化抗體，兩種純化IgG的蛋白濃度分別為1.3 mg/ml（抗harpinXoo）和0.6 mg/ml（抗harpinXooc）。
　　 在酶聯(lián)免疫、Dot blot、Western blot分析中，兩種harpinX的多克隆抗體均能夠檢測(cè)含有harpinX蛋白的不同樣品。兩抗體之間存在一定程度的交叉反應(yīng)，即：harpinXoo蛋

7、白的多克隆抗體能夠識(shí)別蛋白harpinXooc，harpinXooc蛋白的多克隆抗體也能夠識(shí)別蛋白harpinXoo。由于hrf1和hrf2基因的推測(cè)產(chǎn)物氨基酸序列一致性達(dá)67.4％，因此它們之間存在交叉反應(yīng)是不意外的。
　　 構(gòu)建了一批植物轉(zhuǎn)基因雙元載體，包括含有nptⅡ卡那霉素標(biāo)記基因的hrf1基因單價(jià)載體pBⅠ-hrf1-nptⅡ；含有bar除草劑標(biāo)記基因的hrf1基因單價(jià)載體pCAMBIA-hrf1-bar，hrf2基因

8、單價(jià)載體pCAMBIA-hrf2-bar，hrf1和hrf2基因雙價(jià)載體pCAMBIA-hrf1-hrf2-bar，根據(jù)棉花遺傳密碼子優(yōu)化的hrf2基因單價(jià)載體pCAMBIA-Mhrf2-bar；沒(méi)有標(biāo)記基因的hrf2基因單價(jià)載體pCAMBIA-hrf2。
　　 利用花粉管通道技術(shù)將上述轉(zhuǎn)基因雙元載體對(duì)棉花進(jìn)行了轉(zhuǎn)化。收獲的種子種植于黃萎病病圃。棉花長(zhǎng)至3～4片真葉時(shí)，進(jìn)行卡那霉素和除草劑涂抹篩選，共進(jìn)行3次，絕大部分棉苗都因葉

9、片變色而被剔除，只有極少數(shù)不到1％（0.57～0.98％）的棉苗表現(xiàn)出卡那霉素或除草劑抗性；而有關(guān)海島棉新海21的轉(zhuǎn)基因組合可能是由于獲得的種子太少的原因，沒(méi)有篩選到抗性苗。
　　 經(jīng)過(guò)苗期的卡那霉素或除草劑篩選后，對(duì)篩選得到的卡那霉素或除草劑抗性植株及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓旰透胁?duì)照植株的黃萎病情進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)?？敲顾鼗虺輨┛剐灾仓甑狞S萎病發(fā)病率明顯低于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓辏?0％左右（83.3％和77.3％）降至50％多（57.1％

10、、58.7％和55.30％），病情指數(shù)也由30多降至20多?？剐灾仓曛斜磉_(dá)harpinX蛋白轉(zhuǎn)基因植株的存在很可能就是發(fā)病率和病情指數(shù)降低的原因。
　　 選擇部分抗病性較好的卡那霉素或除草劑抗性植株進(jìn)行了PCR檢測(cè)。hrf1或hrf2全長(zhǎng)基因擴(kuò)增陽(yáng)性的株系，用其內(nèi)部引物擴(kuò)增仍為陽(yáng)性，但用vector引物、35S引物、NOS引物依次檢測(cè)上述陽(yáng)性株系時(shí)發(fā)現(xiàn)僅有部分植株為陽(yáng)性，這說(shuō)明整合進(jìn)入棉花基因組的外源片段情況比較復(fù)雜，有些可能只

11、是hrfX基因已經(jīng)整合進(jìn)棉花基因組，而表達(dá)調(diào)控元件如啟動(dòng)子或終止子并沒(méi)有進(jìn)入棉花基因組。最后nptⅡ引物或bar引物檢測(cè)表明，上述檢測(cè)陽(yáng)性的卡那霉素或除草劑抗性植株都能擴(kuò)出陽(yáng)性條帶。
　　 提取PCR檢測(cè)均為陽(yáng)性的植株的可溶性蛋白，進(jìn)行了Western blot和生物活性分析。結(jié)果顯示，并不是所有的PCR陽(yáng)性植株而只是部分植株可檢測(cè)到harpinX蛋白的表達(dá)。這說(shuō)明基因及其表達(dá)調(diào)控元件即使都整合進(jìn)入受體基因組，也不能確保基因的表

12、達(dá)。
　　 黃萎病抗性表現(xiàn)較好以及分子檢測(cè)和生物活性分析均為陽(yáng)性的單株后代，黃萎病抗性表現(xiàn)較好沒(méi)有進(jìn)行分子驗(yàn)證和生物活性分析的混合后代，再次進(jìn)行了黃萎病抗性分析。其中某些單株后代（A-1，A-3和B-1）和混合后代（A-X）已達(dá)到耐病水平，而單株后代H-1達(dá)到抗病水平。
　　 有關(guān)棉花單鈴籽棉均重、衣分和纖維平均長(zhǎng)度的數(shù)據(jù)顯示，轉(zhuǎn)基因品系保持了出發(fā)品種的品質(zhì)，沒(méi)有發(fā)生明顯變化。
　　 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化棉花莖尖組織后，在

13、篩選培養(yǎng)基MSb上培養(yǎng)兩周得到了一定數(shù)量的抗性苗，但切取抗性苗心芽再次在MSb培養(yǎng)基上篩選，沒(méi)有得到抗性苗。說(shuō)明該實(shí)驗(yàn)中所得抗性苗均為嵌合體，而且新生部分為非轉(zhuǎn)化細(xì)胞。因此，作者認(rèn)為現(xiàn)有的莖尖轉(zhuǎn)化技術(shù)不能很好地應(yīng)用于棉花轉(zhuǎn)基因研究，尚需進(jìn)一步改進(jìn)。
　　 下胚軸是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化棉花研究中最常用的外植體。本研究中發(fā)現(xiàn)，暗培養(yǎng)的無(wú)菌苗下胚軸非常脆，進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)時(shí)，愈傷組織的產(chǎn)生頻率很低，而由光/暗交替處理的無(wú)菌苗所得到的外植體產(chǎn)生愈

14、傷組織較快，質(zhì)量好，產(chǎn)生頻率也較高。
　　 總之，作者構(gòu)建了水稻黃單胞harpinX蛋白的融合表達(dá)載體，純化了harpinX蛋白，制備了harpinx的多克隆抗體，并對(duì)兩種harpinX多克隆抗體的相互檢測(cè)進(jìn)行了研究；同時(shí)，利用花粉管通道技術(shù)將harpinX蛋白編碼基因hrfX轉(zhuǎn)入棉花，經(jīng)過(guò)分子驗(yàn)證和表達(dá)蛋白生物活性檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因棉花表現(xiàn)出一定的黃萎病抗性，某些單株后代仍保持一定的抗性，且轉(zhuǎn)基因品系保持了出發(fā)品種的品質(zhì)；農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)h