Fkbp19基因的初步研究及抗體制備.pdf

1、我們利用芯片篩選的方式首先發(fā)現(xiàn)Fkbp19在HBx-p21轉(zhuǎn)基因小鼠的HCC組織中是高表達(dá)的，并用Northern blot的方法進(jìn)行了驗(yàn)證；而且在病人HCC組織中檢測Fkbp19的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，有75％的病例顯示Fkbp19在HCC組織的表達(dá)量要高于正常組織。這提示Fkbp19的異常高表達(dá)與HCC的發(fā)生發(fā)展有著較高的相關(guān)性。
　　 回顧文獻(xiàn)我們發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)kbp19是一個(gè)功能未知基因，目前僅有一篇文獻(xiàn)報(bào)道它是FKBP家族的一個(gè)成員并具

2、有就較弱的FK506結(jié)合能力。通過對(duì)Fkbp19的基因和蛋白結(jié)構(gòu)分析我們發(fā)現(xiàn)它有可能定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及核仁上。Northern blot檢測顯示其在多種外分泌腺中有表達(dá)，亞細(xì)胞定位研究發(fā)現(xiàn)其可以定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核仁及線粒體上。這些結(jié)果提示Fkbp19與蛋白的合成分泌密切相關(guān)。
　　 接下來我們使用RNAi的技術(shù)來敲低Fkbp19的表達(dá)并檢測相關(guān)細(xì)胞表型的變化。我們選擇了Fkbp19表達(dá)量最高的乳腺癌細(xì)胞系ZR75-1來進(jìn)行此次干涉實(shí)驗(yàn)

3、，經(jīng)過成功的干涉載體構(gòu)建，質(zhì)粒的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染篩選成功得到了穩(wěn)定干涉載體的細(xì)胞。兩種不同敲低效率的檢測顯示我們得到了Fkbp19敲低的細(xì)胞，可以進(jìn)行下步實(shí)驗(yàn)。
　　 我們利用MTT的方法來檢測Fkbp19敲低后細(xì)胞生長能力的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長明顯減慢，而對(duì)細(xì)胞周期(FCM)檢測結(jié)果表明細(xì)胞發(fā)生了G1期阻滯，相應(yīng)的推動(dòng)細(xì)胞經(jīng)過G1/S檢查點(diǎn)的蛋白CDK4及CCND1的表達(dá)也顯著下降。Transwell實(shí)驗(yàn)證明細(xì)胞在敲低Fkbp19表

4、達(dá)后細(xì)胞的遷移能力明顯下降。
　　 由于市面上沒有商品化的Fkbp19的抗體，我們就自行制備了Fkbp19的兔源多克隆抗體：經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)的原核表達(dá)，基于His標(biāo)簽的蛋白純化，免疫家兔，收集血清，我們的得到的抗血清可以很好的用于Western blot檢測內(nèi)源以及外源表達(dá)的Fkbp19蛋白。
　　 總之，我們發(fā)現(xiàn)Fkbp19的表達(dá)在小鼠和人的HCC組織中是升高的，在外分泌腺高表達(dá)并與蛋白的合成分泌關(guān)系密切。敲低Fkbp