病毒VdCV1OTU基因的蛋白表達(dá)及抗體制備.pdf

1、棉花黃萎病是我國以及世界棉花作物的主要病害之一，難以防治。對此現(xiàn)狀，尚需探索新的可能的防治方法。Ovarian Tumor protease（OTU蛋白酶）具有去泛素化、降低寄主免疫力、增強(qiáng)病毒侵染性的功能。真菌病毒Verticillium dahliae chrysovirus1（VdCV1）的OTU蛋白可能也具有去泛素化、使真菌免疫力下降、增強(qiáng)病毒侵染性的功能，對利用OTU基因及真菌病毒防治棉花黃萎病菌及其它真菌具有重要意義。本課題

2、開展病毒VdCV1的OTU蛋白的表達(dá)、純化和抗體制備研究，以獲得OTU蛋白及其多克隆抗體，為探明病毒VdCV1的OTU蛋白的功能作必要的基礎(chǔ)準(zhǔn)備。
　　本課題首先開展了病毒VdCV1的OTU蛋白的原核表達(dá)。采用Gateway技術(shù)經(jīng)過BP反應(yīng)和LR反應(yīng)，將OTU基因的編碼區(qū)序列2469 bp克隆至原核表達(dá)載體pET42-DEST（含6個組氨酸序列標(biāo)簽）中，得到重組的原核表達(dá)質(zhì)粒pET42-VcR4。轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，以1mM I

3、PTG37℃誘導(dǎo)4h，產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳表明獲得了97KD的目的蛋白，并經(jīng)His標(biāo)簽抗體Western blotting鑒定正確。
　　然后本課題進(jìn)行了OTU蛋白的原核表達(dá)產(chǎn)物的純化、復(fù)性和多克隆抗體制備。采用親和層析純化法與分子篩層析相結(jié)合的純化方法，獲得純化的OTU蛋白；采用透析復(fù)性法與層析柱鎳螯合復(fù)性方法，獲得了可溶性O(shè)TU蛋白；采用皮下免疫大白兔的方法獲得了OTU蛋白的多克隆抗體。以制備的多克隆抗體為一抗與HRP標(biāo)

4、簽的羊抗兔為二抗做Western blotting鑒定，檢測到菌株Bl21表達(dá)的OTU蛋白存在。
　　最后本課題開展了植物病毒Foxtail mosaic virus（FoMV）外源蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)研究。構(gòu)建了pCB301-FOMV-VcR4、pCB301-FOMV-GFP表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌并浸潤接種本氏煙，經(jīng)紫外燈檢測綠色熒光和SDS-PAGE電泳表明，pCB301-FOMV-VcR4、pCB301-FOMV-GFP表