胰腺發(fā)育相關(guān)maf基因在β細(xì)胞前體誘導(dǎo)分化過程中的表達(dá)變化.pdf

1、研究背景與目的：隨著胰島移植治療糖尿病的逐步開展和深入，供體的缺乏成為一個(gè)關(guān)鍵問題，體外獲得胰島素分泌細(xì)胞成為當(dāng)務(wù)之急。胰腺導(dǎo)管上皮作為重要的β細(xì)胞前體來源，引起了越來越多的重視。近來有很多研究從胰腺導(dǎo)管上皮體外經(jīng)刺激因子誘導(dǎo)得到了分泌胰島素的類胰島細(xì)胞。在這一過程中，胰腺發(fā)育相關(guān)的許多轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平都發(fā)生了相應(yīng)的變化，這些與胰腺發(fā)育內(nèi)分泌細(xì)胞分化成熟相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子包括ngn3，pdx-1，neuroD1，Pax6，nkx6.1等，

2、迄今對(duì)于這些基因的研究已經(jīng)比較成熟。而最新在胰島中鑒定出來的調(diào)控胰島素表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子mafa，及其家族成員mafb，c-maf在此過程中的表達(dá)還不清楚。先前研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)maf蛋白家族亞群——大maf蛋白包括mafa，mafb，c-maf，NRL在機(jī)體很多組織如晶狀體，腦，腎，免疫組織中普遍表達(dá)并調(diào)控細(xì)胞發(fā)育分化，目前研究表明在胰島中負(fù)責(zé)調(diào)控胰島素的表達(dá)和內(nèi)分泌細(xì)胞的發(fā)育。為探索maf基因（主要是mafa，mafb，c-maf）在導(dǎo)管來源

3、的β細(xì)胞前體體外誘導(dǎo)發(fā)育過程中的表達(dá)變化，首先檢測(cè)作為β細(xì)胞前體的胰腺導(dǎo)管上皮中是否有maf系列基因的表達(dá)，進(jìn)而在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和原代細(xì)胞實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上檢測(cè)它們的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化，參照maf與其他經(jīng)典轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)變化，可以更深入全面的理解胰腺發(fā)育通路及其中的關(guān)鍵基因，并找出更合適的干預(yù)切入點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)體外成功獲得可移植β細(xì)胞的目標(biāo)。 材料與方法：首先利用顯微切割技術(shù)獲得高純度小鼠胰腺原位導(dǎo)管上皮細(xì)胞，胰島細(xì)胞及外分泌組織細(xì)胞作為三組標(biāo)本，通過r

4、eal-time PCR檢測(cè)三組中mafa，mafb，c-maf的mRNA表達(dá)情況。進(jìn)而建立高脂肥胖的C57BL小鼠動(dòng)物模型，建模結(jié)束后檢測(cè)血清生化指標(biāo)，進(jìn)行葡萄糖耐量試驗(yàn)和胰島素耐量試驗(yàn)，確定存在胰島素抵抗基礎(chǔ)上處死小鼠取胰腺制備切片，進(jìn)行冰凍切片顯微切割，獲得胰腺導(dǎo)管上皮和胰島細(xì)胞標(biāo)本，利用熒光定量PCR對(duì)三個(gè)maf基因mRNA水平進(jìn)行相對(duì)定量。最后通過小鼠導(dǎo)管上皮細(xì)胞原代分離，體外培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增，然后經(jīng)表皮生長(zhǎng)因子EGF，成纖維細(xì)胞

5、生長(zhǎng)因子rFGF聯(lián)合作用誘導(dǎo)分化獲得類胰島細(xì)胞團(tuán)。采誘導(dǎo)后3天，5天，7天時(shí)間點(diǎn)標(biāo)本及顯微切割獲得的未誘導(dǎo)導(dǎo)管上皮細(xì)胞進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量，同時(shí)對(duì)三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞免疫組化染色鑒定胰島素是否表達(dá)。實(shí)時(shí)定量待檢基因包括maf及一些與胰腺發(fā)育分化有關(guān)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，得到它們?cè)谡T導(dǎo)前后的表達(dá)變化，探討maf在胰島細(xì)胞發(fā)育中的可能作用以及與其他基因的相互關(guān)系。 結(jié)果： 1）區(qū)別于外分泌組織，胰腺導(dǎo)管上皮和胰島細(xì)胞中均有mafa，maf

6、b，c-maf的表達(dá)，且c-maf在導(dǎo)管上皮中的表達(dá)高于胰島。 2)在肥胖激活體內(nèi)導(dǎo)管上皮細(xì)胞分化的前提下，對(duì)比于正常對(duì)照組，胰島中maf的表達(dá)沒有發(fā)生明顯變化，而在導(dǎo)管上皮中，c-maf在肥胖組的表達(dá)明顯高出正常對(duì)照組十幾倍之多，mafa，mafb并沒有明顯變化。 3)胰腺導(dǎo)管上皮經(jīng)體外成功誘導(dǎo)后，3天，5天，7天時(shí)免疫組化試驗(yàn)顯示胰島素陽性，maf的表達(dá)出現(xiàn)了較為復(fù)雜的變化過程。Mafa在7天時(shí)出現(xiàn)了表達(dá)的升高，而之

7、前基本沒有變化；mafb在誘導(dǎo)前期逐漸升高，5天時(shí)出現(xiàn)高峰，而后于7天時(shí)表達(dá)水平回落；c-maf在誘導(dǎo)3天時(shí)表達(dá)水平最高，之后逐漸走低，7天時(shí)的狀態(tài)甚至低于為導(dǎo)管上皮。 結(jié)論：在胰腺發(fā)育過程中，c-maf可能側(cè)重于調(diào)節(jié)分化，在發(fā)育前期起作用，mafb則既有促分化也有保持功能的作用，所以其表達(dá)可能貫穿發(fā)育和成熟始終。而mafa的結(jié)論不甚明朗，關(guān)于mafa調(diào)節(jié)insulin轉(zhuǎn)錄的作用基本沒有異議，但其在導(dǎo)管及誘導(dǎo)前期的表達(dá)水平是否對(duì)