CIK誘導(dǎo)過程中TCR的表達(dá)變化及靶向TCR的基因編輯研究.pdf

1、目的：通過分析T細(xì)胞抗原受體（T cell receptor, TCR）分子在CIK誘導(dǎo)過程中的表達(dá)變化情況，以及 TCR基因的修飾或缺失是否影響 CIK的殺傷活性，分析 CIK中TCR分子是否發(fā)揮了功能，為以后基于CIK的特異性TCR基因修飾用于靶向治療腫瘤的研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　一、CIK細(xì)胞培養(yǎng)過程中TCR表達(dá)譜的變化研究
　　采集健康志愿者外周血，F(xiàn)icoll法分離單個(gè)核細(xì)胞，按照 CIK誘導(dǎo)方法完成

2、對CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)，并在0天、7天和14天分別取樣，經(jīng)過流式分選不同表型細(xì)胞，分別提取總RNA，經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄，多重PCR擴(kuò)增，然后利用GeXP多重基因分析系統(tǒng)分析各組樣品中22個(gè)TCRVβ亞家族的CDR3長度和譜型，并利用內(nèi)參GAPDH平衡各組之間的差異，計(jì)算出各TCRVβ亞家族的表達(dá)量，分析不同時(shí)間以及不同組之間的差異變化。
　　二、CIK細(xì)胞轉(zhuǎn)染特異性TCR后殺傷功能的檢測
　　擴(kuò)增survivin抗原肽優(yōu)勢取用基因T

3、CR Vα4、Vβ7的重組腺病毒Ad5/F35-pDC315-TCRVα4-IRES-Vβ7，病毒滴度測定,按 MOI比為1:20感染培養(yǎng)7天的CIK細(xì)胞，感染48小時(shí)，以30:1的效靶比殺傷四種不同腫瘤細(xì)胞系，對比感染前后殺傷功能的變化。
　　三、7402-TCR-YFP穩(wěn)轉(zhuǎn)系的建立
　　構(gòu)建 cDNA3.1-TCR-YFP質(zhì)粒，經(jīng)過線性化酶切，轉(zhuǎn)染處于對數(shù)增殖期的7402細(xì)胞系，經(jīng)過 G418篩選，初步建立穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系

4、，然后經(jīng)單克隆篩選，建立7402-TCR-YFP單克隆細(xì)胞系。
　　四、CRISPR-Cas9-TCRBC敲除質(zhì)粒的構(gòu)建及其功能驗(yàn)證
　　利用CRISPR網(wǎng)站提供的靶向編輯位點(diǎn)篩選工具，設(shè)計(jì)出3個(gè)敲除位點(diǎn)，并針對這三個(gè)位點(diǎn)構(gòu)建 CRISPR-Cas9-TCR敲除質(zhì)粒，其中包括不帶熒光的 PX330和帶有GFP的PX458質(zhì)粒，并用構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染穩(wěn)轉(zhuǎn)的7402細(xì)胞系、常規(guī)HepG2細(xì)胞系，通過流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合PCR、T-A克隆

5、測序等方法驗(yàn)證CRISPR-Cas9-TCR敲除質(zhì)粒的功能。
　　結(jié)果：
　　一、CIK誘導(dǎo)培養(yǎng)之后TCR表達(dá)譜并未發(fā)生太大變化。
　　利用GeXP多重基因分析系統(tǒng)完成對0天CD3+T、CD3+CD8+T、CD3+CD4+T,7天 CD3+T、CD3+CD56+T、CD3+CD56-T以及14天 CD3+T、CD3+CD56+T、CD3+CD56-T細(xì)胞群的 TCRVβCDR3表達(dá)譜的研究工作。從整體水平上看，隨著培養(yǎng)

6、時(shí)間的延長，TCR表達(dá)譜并未出現(xiàn)較大偏移，每個(gè)家族都呈現(xiàn)出典型的多克隆鐘形分布，只有0天在T細(xì)胞中檢測到寡克隆表達(dá)的Vβ8和Vβ16家族，選擇性的在CD3+CD56+T細(xì)胞群中出現(xiàn)較高表達(dá)，而沒有在CD3+CD56-T細(xì)胞群中出現(xiàn)單克隆性高表達(dá)，并且在Vβ16在CD3+CD56+細(xì)胞群中的比例高于初始CD3+CD8+T細(xì)胞中的比例。
　　二、轉(zhuǎn)Survivin特異性TCR的CIK細(xì)胞對HLA-A2+Survivin+腫瘤細(xì)胞有顯著

7、增強(qiáng)
　　成功擴(kuò)增Survivin特意性的Ad5/F35-pDC315-TCRVα4-IRES-Vβ7重組腺病毒，以MOI比為1:20感染培養(yǎng)7天的CIK細(xì)胞，48小時(shí)后，用TCRBV7抗體檢測轉(zhuǎn)染后 CIK細(xì)胞陽性率為9.7％（對照組為4.5%），鈣黃綠素釋放法檢測轉(zhuǎn)染后的 CIK細(xì)胞對7402、HepG2、MCF-7、H1299四種靶細(xì)胞殺傷效率，發(fā)現(xiàn)CIK細(xì)胞轉(zhuǎn)染Survivn特異性 TCR基因后，對HepG2（HLA-A2

8、+、Survivin+）和MCF-7（HLA-A2+、Survivin+）殺傷效果大大增強(qiáng)，然而對于肝癌細(xì)胞株7402（HLA-A2-、Survivin+）和H1299（HLA-A2-、Survivin-）的殺傷能力卻并沒有明顯增強(qiáng)效果。
　　三、成功構(gòu)建7402-TCR-YFP穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系
　　成功構(gòu)建7402-TCR-YFP穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，并通過單克隆培養(yǎng)，建立單克隆細(xì)胞系流式檢測YFP熒光效率為70%。
　　四、成功構(gòu)

9、建CRISPR-Cas9-TCRBC質(zhì)粒，并完成功能驗(yàn)證
　　針對設(shè)計(jì)的3個(gè)靶位點(diǎn)成功構(gòu)建出，PX330和PX458兩種敲除質(zhì)粒，用三種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染穩(wěn)轉(zhuǎn)7402細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)S位點(diǎn)敲除效率最高，轉(zhuǎn)染5天流式檢測7402穩(wěn)轉(zhuǎn)系熒光率從75%下降到35%。然后利用PX458-S質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞系，流式檢測轉(zhuǎn)染效率為22.4%，然后提取基因組DNA，通過PCR，T-A克隆測序，在20個(gè)單克隆中有4個(gè)發(fā)生插入，且插入堿基均為單一A堿基，插

10、入位點(diǎn)均為PAM位點(diǎn)上游第4個(gè)堿基處，整體突變率為20%，相對于轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞比例22.4%，有效編輯率約為89.2%。
　　結(jié)論：
　　成功建立CIK細(xì)胞不同天數(shù)、不同亞群的TCRVβ表達(dá)譜，通過對比發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)過程中，絕大多數(shù)表達(dá)譜沒有發(fā)生偏移，但是對于有些特異性的T細(xì)胞，卻出現(xiàn)了分布的差異性。成功擴(kuò)增Survivin特異性重組腺病毒，轉(zhuǎn)染CIK，殺傷實(shí)驗(yàn)初步證明了CIK細(xì)胞中 TCR的作用。成功構(gòu)建7402-TCR-Y