嵌合TCR分子在T細胞中表達、組裝和功能的研究.pdf

1、本課題希望對結(jié)構(gòu)域替換后的嵌合TCR分子的配對組裝情況、結(jié)合CD3分子的能力、以及識別抗原和傳遞活化信號的能力的研究，為TCR基因修飾T細胞的過繼性治療研究及其臨床應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。
　　一、γδTCR基因的獲取及嵌合TCR分子生物信息學分析
　　該部分研究目的是確定αβTCR、γδTCR、CD3ζ結(jié)構(gòu)域替換位點，設(shè)計出結(jié)構(gòu)穩(wěn)定合理的嵌合TCR分子。
　　結(jié)果顯示IMGT數(shù)據(jù)庫比對分析確定了我們篩選分離獲得的TCRα1

2、2、β7、γ9和δ2鏈V-D-J或V-J連接區(qū)基因共同編碼的CDR3高變區(qū)。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示在V結(jié)構(gòu)域的CDR3高變區(qū)后都存在一個折疊區(qū)域，之后以一段loop形式與TCR的C區(qū)結(jié)構(gòu)域相連接。綜合比較幾種跨膜軟件預(yù)測結(jié)果，確定了TCRα12、β7、γ9、δ2和CD3ζ的跨膜區(qū)域。三維結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)TCRα12與TCRδ2結(jié)構(gòu)的同源性較高，TCRβ7和TCRγ9結(jié)構(gòu)的同源性較高，并與預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)進行比較最終確定了結(jié)構(gòu)域替換的位點。對嵌合

3、TCR分子的三維建模結(jié)果顯示，嵌合TCR分子能維持原αβTCR蛋白V區(qū)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。
　　因此，該部分通過生物信息學分析確定了結(jié)構(gòu)域替換位點成功設(shè)計了4種嵌合TCR分子，且這些嵌合TCR分子的結(jié)構(gòu)域具有良好的穩(wěn)定性。
　　二、嵌合TCR分子的克隆以及腺病毒的包裝
　　本部分的研究目的是構(gòu)建一組可用于FRET檢測的含熒光蛋白的嵌合TCR分子雙表達載體，以及一組不含熒光蛋白的嵌合TCR腺病毒穿梭載體并包裝出具有感染能力的腺病

4、毒。
　　結(jié)果成功設(shè)計了4套重疊PCR引物，并通過重疊PCR一步法成功獲得chimTCRα和chimTCRβ的融合基因;成功構(gòu)建了4種含熒光蛋白的真核雙表達載體pIRES-chimTRBYFP-chimTRACFP;成功構(gòu)建了4種不含熒光蛋白的腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC315-chimTRB-IRES-chimTRA，并包裝出了具有感染能力的重組腺病毒，通過PCR驗證chimTCRs整合至病毒基因組中;4種重組嵌合腺病毒的滴度都在109

5、IU/ml以上，并可有效轉(zhuǎn)染Jukat細胞，以MOI=100(PFU)感染時間為48h時，嵌合TCR的表達效率最高。
　　因此，本部分成功構(gòu)建了含熒光蛋白的4種嵌合TCR分子的雙表達載體，另外成功構(gòu)建了不含熒光蛋白的嵌合TCR腺病毒穿梭載體并包裝出了具有感染能力的重組嵌合腺病毒。
　　三、嵌合TCR分子的表達和配對組裝分析
　　本部分的目的是研究嵌合TCR分子在受體細胞的表達水平、自身的配對能力以及與內(nèi)源TCR分子的錯

6、配程度。
　　將這4種攜帶熒光蛋白的重組表達質(zhì)粒pIRES-chimTRBYFP-chimTRACFP轉(zhuǎn)染BEL-7402和Jurkat細胞，并通過激光掃描共聚焦顯微鏡掃描轉(zhuǎn)染細胞，其中458nm激發(fā)波長激發(fā)供體chimTRACFP，515 nm激發(fā)波長激發(fā)受體chimTRBYFP，然后掃描細胞獲得熒光圖像，其中掃描ECFP通道獲得青色熒光圖象，EYFP通道獲得黃色熒光圖象。然后利用致敏受體發(fā)射方法(sensitizedaccep

7、tor emission method，SE)進行分析獲得pFRET和FRET效率熒光圖片，接著每個樣本選擇4組細胞的FRET效率熒光圖片，并在每組細胞FRET效率熒光圖片上隨機選取5個興趣點(ROI)的熒光值進行進一步的統(tǒng)計學分析，比較各嵌合TCR分子的相互作用，確定其與內(nèi)源TCR的錯配情況。將4種不攜帶熒光蛋白的嵌合TCR重組腺病毒轉(zhuǎn)染Jurkat細胞，72h后收獲細胞，并以TCRVβ7-PE、TCR Vα12-FITC抗體染色，流

8、式細胞術(shù)檢測各嵌合TCR分子Vβ7和Vα12的表達。
　　結(jié)果顯示4種攜帶熒光蛋白的嵌合TCR分子能定位于細胞膜表面并正常表達，特別是chim4TCR在沒有CD3分子存在的情況下也能非常強烈的表達于細胞表面，這意味著chim4TCR在細胞中的表達可以不依賴于CD3分子。SE-FRET以及統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn)，chim1TCR和chim2TCR在兩種細胞的FRET效率都高于wtTCR，但是依然與內(nèi)源TCR產(chǎn)生了少量的雜合TCR分子。雖然c

9、him1TCR和chim2TCR在Jurkat細胞中不能避免錯配，但相比于wtTCR在一定程度上減少了錯配。chim3TCR和chim4TCR在BEL-7402細胞和Jurkat細胞的FRET效率無統(tǒng)計學差異，這提示chim3TCR和chim4TCR能避免錯配。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)chim1TCR、chim2TCR和chim4TCR在Jurkat細胞表面的表達水平高于wtTCR，而chim3TCR在Jurkat細胞表面的表達效率最低，

10、特別是chim4TCR相比于未經(jīng)改造的wtTCR及其他3種嵌合TCR其表面表達水平大大提高。
　　因此，該部分研究表明chim4TCR不僅能夠避免與內(nèi)源TCR的錯配，且其在T細胞系以及非T細胞系表面表達水平都遠遠高于另3種chimTCR分子和wtTCR分子。chim3TCR雖然能避免錯配但是表達水平卻相比于wtTCR有所下降。chim1TCR和chim2TCR其表達相比于wtTCR稍有提高但是不能避免錯配。
　　四、嵌合TC

11、R基因轉(zhuǎn)染T細胞功能的研究
　　該部分的目的是研究各chimTCR分子與CD3ζ的相互作用及信號傳遞能力，分析各chimTCR分子轉(zhuǎn)染T細胞后對腫瘤細胞的CTL效應(yīng)及細胞因子分泌情況以探討其抗原識別能力，最后檢測了chim4TCR在細胞內(nèi)的信號初始狀態(tài)。
　　通過第一章生物信息學分析的各TCR與CD3ζ的跨膜區(qū)域和胞內(nèi)區(qū)域，設(shè)計了能采用FRET方法分析TCR與CD3ζ相互作用的一對攜帶熒光蛋白的質(zhì)粒。構(gòu)建了作為供體的4種pI

12、RES-chimTRB-chimTRACFP質(zhì)粒和作為受體的pIRES-CD3ζTMYFP和pIRES-CD3ζYFP重組質(zhì)粒。將以上質(zhì)粒分別共轉(zhuǎn)染BEL-7402細胞，激光共聚焦掃描顯微鏡掃描CFP和YFP在BEL-7402細胞內(nèi)的表達，SE-FRET分析嵌合TCR與CD3ζ的相互作用。分離健康人PBMC，并篩選出HLA-A2+陽性樣本，將wtTCR及4種chimTCR的重組腺病毒轉(zhuǎn)染PBMC并設(shè)未轉(zhuǎn)染TCR對照組，72h后與HLA-

13、A2+的靶細胞HepG-2，Huh-1以及HLA-A2-的靶細胞BEL-7402以效靶比30∶1～1∶1共孵育，作用4h后采用鈣黃綠素(Calcein-acetoxymethyl，CAM)釋放法檢測各組TCR轉(zhuǎn)PBMC對腫瘤細胞的殺傷效應(yīng);24h后ELISA檢測各組TCR轉(zhuǎn)PBMC的IFN-γ分泌水平。最后分別轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒chim4TCRYFP或CD3ζYFP至BEL-7402和Jurkat細胞，采用DiD對細胞膜進行染色，激光共聚焦掃

14、描顯微鏡以515nm激發(fā)波長和635nm激發(fā)波長分別激發(fā)YFP和DiD，發(fā)射波長由500nm～700nm掃描細胞獲得熒光圖像，之后通過細胞膜共定位分析chim4TCR在細胞內(nèi)信號初始狀態(tài)。
　　統(tǒng)計學處理:實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差來表示。應(yīng)用SPSS(R) v19.0軟件(SPSS Inc.，Chicago，USA)進行統(tǒng)計分析。各指標先進行正態(tài)性及Levene's test方差齊性檢驗。數(shù)據(jù)比較采用析因設(shè)計，分析兩種干預(yù)交互作用、

15、單獨效應(yīng)及主效應(yīng)。采用單因素方差分析和t檢驗完成單因素數(shù)據(jù)分析，多重比較使用LSD法。當P＜0.05時，被認為差異具有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果顯示wtTCR和前3種嵌合γδTCR的chimTCR分子與CD3ζTM的FRET效率較低，提示這些TCR與CD3ζ在BEL-7402細胞中的相互作用較弱。而chim4TCR與CD3ζ能明顯檢測到FRET，提示chim4TCR中融合的CD3ζ依然能與CD3ζ有一定的相互作用，但是其程度低于chi

16、m4TCRαζ和chim4TCRβζ之間的相互作用。另外細胞毒實驗結(jié)果表明chim4TCR、chim1TCR和wtTCR轉(zhuǎn)染PBMC細胞能有效殺傷HLA-A2+的靶細胞，其中chim4TCR對靶細胞的裂解能力高于chim1TCR和wtTCR。但是chim2TCR和chim3TCR轉(zhuǎn)PBMC與未轉(zhuǎn)TCR的PBMC對HLA-A2+的靶細胞的殺傷效應(yīng)沒有統(tǒng)計學差異，提示chim2TCR和chim3TCR可能在識別特異性抗原或信號傳遞方面能力受

17、損。各組chimTCRs以及wtTCR轉(zhuǎn)染T細胞對HLA-A2-的靶細胞沒有表現(xiàn)出殺傷效應(yīng)。此外作用于HLA-A2+的靶細胞后，chim4TCR、wtTCR和chim1TCR基因轉(zhuǎn)染PBMC能分泌的IFN-γ，其中chim4TCR基因轉(zhuǎn)染組分泌的IFN-γ高于wtTCR和chim1TCR基因轉(zhuǎn)染組，而chim2TCR和chim3TCR與未經(jīng)轉(zhuǎn)染TCR的對照組相比無統(tǒng)計學差異。作用于HLA-A2-的靶細胞BEL-7402后，IFN-γ分泌

18、水平均沒有顯著性差異。最后通過細胞膜共定位分析發(fā)現(xiàn)Chim4TCR或CD3ζ都共定位于膜上，確定了Chim4TCR在T細胞內(nèi)信號屬于未活化的初始狀態(tài)。
　　因此，該部分研究證實Chim4TCR依然能與CD3ζ有一定的相互作用;Chim4TCR、chim1TCR依然保持原wtTCR的HLA-A2限制性，并具有良好的抗原特異性及信號傳遞能力，chim2TCR和chim3TCR可能失去了抗原識別能力或是信號傳遞能力受損而不足以促進細胞因