雙自殺基因系統(tǒng)以及轉(zhuǎn)染縫隙連接蛋白43對膽管癌抑制作用的實驗研究.pdf

1、膽管癌是膽道系統(tǒng)的原發(fā)性惡性腫瘤，惡性程度較高，預(yù)后較差。膽管癌早期一般不易被發(fā)現(xiàn)，等出現(xiàn)黃疸等臨床癥狀時已達臨床中晚期，失去了根治性切除的機會。術(shù)中和術(shù)后的放、化療對中晚期腫瘤及腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移效果較差，而且大劑量的放、化療會產(chǎn)生較大的毒副作用，急需尋找新的治療方法。 目前對于包括膽管癌在內(nèi)的惡性腫瘤，尤其是晚期惡性腫瘤的基因治療研究中，自殺基因治療占有重要的地位。自殺基因系統(tǒng)中應(yīng)用最多的是單純皰疹病毒胸苷激酶基因/丙氧鳥苷系

2、統(tǒng)和胞嘧啶脫氨酶基因/5-氟胞嘧啶系統(tǒng)。 但是近年來的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單一的自殺基因治療有許多問題有待解決，如殺傷力低、耐藥性高和毒副作用大等。為了提高自殺基因的療效出現(xiàn)了聯(lián)合基因療法，其中包括雙自殺基因的聯(lián)合應(yīng)用。 為了研究自殺基因系統(tǒng)對膽管癌的抑制作用，本課題觀察雙自殺基因系統(tǒng)對于裸鼠膽管癌移植瘤的治療作用以及雙自殺基因系統(tǒng)治療膽管癌過程中的旁觀者效應(yīng)。 自殺基因治療的優(yōu)勢在于存在旁觀者效應(yīng)(bystander

3、effect，BE)，增強了自殺基因治療的療效。但是大多數(shù)腫瘤細胞縫隙連接蛋白表達水平低下，導(dǎo)致縫隙連接細胞間通訊功能受損或缺陷。 為了探討和解決這一問題，本課題首先構(gòu)建了縫隙連接蛋白43基因的真核表達載體，再將Cx43基因?qū)肽懝馨┘毎?，使膽管癌細胞的Cx43蛋白獲得高表達，通過上調(diào)膽管癌細胞的GJIC以促進BE，進一步提高自殺基因治療的療效。 第一部分重組Cx43-pcDNA6/myc-HisA真核表達載體的構(gòu)建

4、 目的 為了提高膽管癌細胞中Cx43蛋白的表達水平，我們構(gòu)建一種包含Cx43基因開放閱讀框(openreadingframe，ORF)序列的真核表達載體，將此載體轉(zhuǎn)染入膽管癌細胞，使膽管癌細胞穩(wěn)定表達Cx43蛋白。 方法 1.根據(jù)質(zhì)粒PSG5-Cx43中包含的Cx43基因ORF序列和空載體pcDNA6/myc-HisA的多克隆位點，設(shè)計多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)的上、下游引物，分別引入BamHI和NotI的酶切位

5、點。 2.以質(zhì)粒PSG5-Cx43為模板，應(yīng)用PCR技術(shù)擴增出Cx43基因的ORF序列，并將PCR產(chǎn)物純化。 3.將純化的PCR產(chǎn)物和空載體pcDNA6/myc-HisA均用BamHI和NotI雙酶切，用T4DNA連接酶將這兩種酶切產(chǎn)物進行連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞。 4.應(yīng)用酶切、PCR和DNA測序的方法對轉(zhuǎn)化菌株進行篩選和鑒定。 結(jié)論 Cx43基因的ORF序列正確克隆入載體pcDNA6/

6、myc-HisA中，Cx43基因真核表達載體Cx43-pcDNA6/myc-HisA已被構(gòu)建成功。 第二部分雙自殺基因系統(tǒng)對體內(nèi)外膽管癌抑制作用的實驗研究 目的 1.比較雙自殺基因系統(tǒng)(HSV-tk基因/GCV和CD基因/5-Fc)聯(lián)合應(yīng)用與應(yīng)用單一自殺基因系統(tǒng)對膽管癌細胞抑制作用的差別。 2.觀察雙自殺基因系統(tǒng)對膽管癌細胞的旁觀者效應(yīng)。 3.觀察雙自殺基因系統(tǒng)對裸鼠膽管癌移植瘤的治療作用和旁觀者

7、效應(yīng)。 方法 1.將含有雙自殺基因的質(zhì)粒pWZLneoCDglytk轉(zhuǎn)染膽管癌QBC939細胞，經(jīng)G418篩選獲得穩(wěn)定表達CD和HSV-tk基因的QBC939/CD+tk細胞。 2.應(yīng)用RT-PCR法擴增QBC939/CD+tk細胞中的CD和HSV-tk基因，凝膠電泳分析CD和HSV-tk基因在QBC939/CD+tk細胞中的表達。 3.對于QBC939/CD+tk細胞和QBC939細胞，分成聯(lián)用5-Fc

8、和GCV組、單用5-Fc組和單用GCV組，按照不同的藥物濃度梯度給藥，并在用藥4天后，采用MTT法測定各組的吸光度，計算細胞生長抑制率(growthinhibitionratio，GIR)。 4.在GCV(1μg/ml)和5-FC(60μg/ml)的濃度下，于給藥后24、48、72和96小時，光鏡觀察下QBC939/CD+tk細胞和QBC939細胞的形態(tài)變化以及生長情況。 5.在GCV(1μg/ml)和5-FC(60μg

9、/ml)的濃度下，用藥2天后，流式細胞儀測定QBC939/CD+tk細胞和QBC939細胞的細胞周期和凋亡率。 6.將QBC939/CD+tk細胞和QBC939細胞按不同的比率混合，按照低、中和高3種濃度給藥，在給藥4天后，采用MTT法測定各組的吸光度，計算GIR。 7.將QBC939/CD+tk細胞和QBC939細胞分別建立裸鼠皮下移植瘤模型。成瘤4周后，按照低、中和高3種劑量腹腔內(nèi)給藥連續(xù)3周，停藥1周后觀察腫瘤大小

10、并計算腫瘤體積。 8.電鏡下觀察中劑量前體藥物作用21天后的QBC939/CD+tk細胞和QBC939細胞形成的裸鼠皮下移植瘤組織。 9.分3組，①組：QBC939/CD+tk細胞和QBC939細胞混合后接種裸鼠；②組：QBC939/CD+tk細胞和QBC939細胞單獨分別接種裸鼠左右兩側(cè)。③組：QBC939細胞接種裸鼠(對照組)。成瘤2周時，立即腹腔內(nèi)注射GCV(50mg/kg體重)和5-Fc(300mg/kg體重)連

11、續(xù)3周，停藥1周后計算腫瘤體積。 結(jié)論 1.在自殺基因系統(tǒng)治療膽管癌中，有凋亡現(xiàn)象發(fā)生。 2.雙自殺基因系統(tǒng)與單自殺基因系統(tǒng)相比，對膽管癌細胞有更強的抑制作用。 3.雙自殺基因系統(tǒng)對早期形成的移植瘤較晚期形成的移植瘤有更好的治療作用。 4.雙自殺基因系統(tǒng)在治療膽管癌中可觀察到一定的旁觀者效應(yīng)。 第三部分縫隙連接蛋白43與自殺基因系統(tǒng)旁觀者效應(yīng)的關(guān)系 目的 1.比較雙自殺基因

12、系統(tǒng)(HSV-tk基因/GCV和CD基因/5-Fc)對于轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染Cx43基因的膽管癌細胞的抑制作用和旁觀者效應(yīng)的差別。 2.比較雙自殺基因系統(tǒng)對于轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染Cx43基因的膽管癌細胞所生成的移植瘤的治療作用和旁觀者效應(yīng)的差別。 方法 1.將質(zhì)粒pWZLneoCDglytk和Cx43-pcDNA6/myc-HisA共轉(zhuǎn)染膽管癌QBC939細胞，經(jīng)G418和Blasticidin雙重篩選獲得穩(wěn)定表達CD、tk和C

13、x43基因的QBC939/CD+tk+Cx43細胞。 2.RT-PCR法擴增CD、tk和Cx43基因，凝膠電泳分析CD、tk和Cx43基因在QBC939/CD+tk+Cx43細胞、QBC939/CD+tk細胞和QBC939細胞中的表達；Westernblot方法測定Cx43蛋白在QBC939/CD+tk+Cx43細胞、QBC939/CD+tk細胞和QBC939細胞中的表達。 3.對于QBC939/CD+tk+Cx43細胞

14、、QBC939/CD+tk細胞和QBC939細胞，按照不同的藥物濃度梯度給藥，在前體藥物應(yīng)用4天后，采用MTT法測定各組的吸光度，計算GIR。 4.在GCV(1μg/ml)和5-FC(60μg/ml)的濃度下，于給藥后24、48、72和96小時，光鏡觀察下QBC939/CD+tk+Cx43細胞、QBC939/CD+tk細胞和QBC939細胞的形態(tài)變化以及生長情況。 5.在GCV(1μg/ml)和5-FC(60μg/ml)

15、的濃度下，在用藥2天后，應(yīng)用流式細胞儀測定QBC939/CD+tk+Cx43細胞、QBC939/CD+tk細胞和QBC939細胞的細胞周期和凋亡率。 6.分2組：①組：QBC939/CD+tk+Cx43細胞和QBC939細胞混合組；②組：QBC939/CD+tk細胞和QBC939細胞混合組。均按不同的比率混合，按低和中2種濃度給藥，在給藥4天后，采用MTT法測定各組的吸光度，計算GIR。 7.將QBC939/CD+tk+

16、Cx43細胞、QBC939/CD+tk細胞和QBC939細胞分別建立裸鼠皮下移植瘤模型。成瘤4周后，按照低、中和高3種劑量腹腔內(nèi)給藥連續(xù)3周，停藥1周后觀察腫瘤大小并計算腫瘤體積。 8.電鏡下觀察中劑量前體藥物作用21天后的QBC939/CD+tk+Cx43細胞、QBC939/CD+tk細胞和QBC939細胞形成的裸鼠皮下移植瘤組織。 9.分4組，A1組：QBC939/CD+tk細胞和QBC939細胞混合后接種裸鼠；B1

17、組：QBC939/CD+tk細胞和QBC939細胞單獨分別接種裸鼠左右兩側(cè)；A2組：QBC939/CD+tk+Cx43細胞和QBC939細胞混合后接種裸鼠；B2組：QBC939/CD+tk+Cx43細胞和QBC939細胞單獨分別接種裸鼠左右兩側(cè)。成瘤2周時，立即腹腔內(nèi)注射GCV(50mg/kg體重)和5-Fc(300mg/kg體重)連續(xù)3周，停藥1周后計算腫瘤體積。 結(jié)論 1.在自殺基因系統(tǒng)治療膽管癌中，有凋亡現(xiàn)象發(fā)生。