冷應(yīng)激對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞縫隙連接蛋白43的影響及藥物干預(yù)的研究.pdf

1、目的：
　　 通過(guò)建立乳鼠心肌細(xì)胞冷應(yīng)激模型觀察不同時(shí)間和溫度下縫隙連接蛋白43表達(dá)的變化，并在抗心律失常肽(AAP10)作用下觀察其對(duì)心肌細(xì)胞間傳導(dǎo)的影響，從而探討心肌細(xì)胞損傷和保護(hù)的病理生理機(jī)制。
　　 方法：
　　 取剛初生1-3天的乳鼠56只，隨機(jī)分為正常組、試驗(yàn)1組：4℃1h、3h和6h，試驗(yàn)2組：0℃10min、30min和1h，以及藥物干預(yù)組(AAP10組)，每組n=6。乳鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)，選培養(yǎng)

2、至5d的心肌細(xì)胞，分別將其置入上述溫度環(huán)境中，并分別予以各時(shí)間段干預(yù)，然后置于37℃水浴箱中復(fù)溫，置孵育箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)6h，建立冷應(yīng)激模型；干預(yù)組在欲刺激前加入100nmol/L抗心律失常肽(AAP10)；然后以流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)目的基因縫隙連接蛋白43(mRNACx43)的表達(dá)變化，以及蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)目的蛋白Cx43和P-Cx43的表達(dá)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　

3、 結(jié)果：
　　 1、心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)：心肌細(xì)胞種板2-4h后，在倒置顯微鏡下觀察到心肌細(xì)胞最初開(kāi)始呈貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)為圓形，后為梭形。第1d顯微鏡觀察可視心肌細(xì)胞伸出較短的偽足，偶可見(jiàn)有單個(gè)較弱搏動(dòng)的心肌細(xì)胞，頻率慢，約20次/分，律齊；第2d細(xì)胞有部分偽足已開(kāi)始融合，搏動(dòng)頻率較前有所加強(qiáng)，但也較緩，第4d心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率明顯，約為75次/分，律齊，并且可觀察到細(xì)胞間己開(kāi)始逐漸相互融合，呈片狀群體性搏動(dòng)，有規(guī)律。第5-6天乳

4、鼠心肌細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，活躍，每搏頻率可達(dá)85次/分以上，律規(guī)整。心肌細(xì)胞在冷應(yīng)激干預(yù)后可視細(xì)胞逐漸分散，核裂解，搏動(dòng)范圍縮小及頻率亦明顯緩慢。
　　 2、流式細(xì)胞儀示4℃和0℃組隨著冷刺激程度的加強(qiáng)和時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)胞凋亡率呈明顯增加，由試驗(yàn)1組(3.02±0.02)％、(6.78±0.01)％、(10.79±0.02)％分別增至試驗(yàn)2組的(6.74±0.01)％、(16.13±0.02)％、(28.52±0.02)％，與對(duì)照組(1.

5、05±0.02)％相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)
　　 3、冷應(yīng)激模型建立后，RT-PCR結(jié)果顯示：4℃1h、3h和6h縫隙連接蛋白43(Cx43)mRNA的表達(dá)低于正常組(1.68±0.01、1.33±0.02、1.01±0.01vs2.01±0.02)，0℃10min、30min和60min組Cx43mRNA表達(dá)亦明顯分別低于正常組(0.86±0.01、0.63±0.01、0.42±0.02vs2.01±0.02)。AA

6、P10干預(yù)后4℃和0℃各組Cx43mRNA的表達(dá)分別為(2.20±0.02vs1.68±0.03、1.66±0.01vs1.33±0.02、1.42±0.01vs1.01±0.01)和(1.20±0.02vs0.86±0.01、0.92±0.01vs0.63±0.01、0.66±0.02vs0.42±0.01)，與對(duì)照組相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)與刺激組相比較統(tǒng)計(jì)學(xué)有差異。
　　 4、冷應(yīng)激模型建立后，提取各組細(xì)胞蛋白，

7、通過(guò)免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)蛋白Cx43及磷酸化縫隙連接蛋白(P-Cx43)的表達(dá)。結(jié)果顯示：4℃1h、3h和6h縫隙連接蛋白43(Cx43)表達(dá)低于對(duì)照組(0.86±0.01、0.72±0.02、0.59±0.01vs1.0±0.01)，且組間比較亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，0℃10min、30min和60min組Cx43蛋白表達(dá)亦明顯分別低于正常組(0.54±0.02、0.40±0.1、0.31±0.02vs1

8、.00±0.01)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，AAP10干預(yù)后，各組Cx43蛋白的表達(dá)呈增加趨勢(shì)，4℃1h.3h和6hCx43的表達(dá)分別為0.95±0.03、0.83±0.01、0.77±0.04；與對(duì)照組(1.00±0.01)及刺激組(0.86±0.01、0.72±0.02、0.59±0.01)比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；0℃10min、30min和60minCx43的表達(dá)分別為0.7

9、4±0.03、0.67±0.02、0.57±0.01，與空白組(1.00±0.01)和刺激組(0.54±0.02、0.40±0.1、0.31±0.02)相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；4℃1h.3h和6h P-Cx43蛋白的表達(dá)分別為(0.82±0.01、0.73±0.02、0.58±0.01 vs1.0±0.02)，與對(duì)照組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，組間比較亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，0℃10min、30min和60m

10、inP-Cx43蛋白的表達(dá)分別為(0.60±0.01、0.51±0.01、0.30±0.01vs1.0±0.02)，與正常組和組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，AAP10干預(yù)后，各組P-Cx43蛋白的表達(dá)亦有所增加，41h.3h和6h P-Cx43的表達(dá)分別為0.88±0.04、0.80±0.02、0.73±0.01，與對(duì)照組(1.00±0.01)及刺激組(0.82±0.01、0.73±0.02、0.58±0.01)相比均有統(tǒng)

11、計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，0℃10min、30min和60minP-Cx43的表達(dá)分別為0.75±0.03、0.68±0.02、0.41±0.03，和對(duì)照組相比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；同時(shí)與相應(yīng)各冷刺激組(0.60±0.01、0.51±0.01、0.30±0.01)比較差異亦呈統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、急性冷應(yīng)激條件下，心肌細(xì)胞易受損，心肌細(xì)胞的凋亡率呈逐漸增加趨勢(shì)。