清胰化積方對人胰腺癌肝轉(zhuǎn)移的實驗研究.pdf

1、概述
　　胰腺癌(Pancreaticcarcinoma)是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤,近年來發(fā)病率呈上升趨勢。胰腺癌也是預(yù)后最差的惡性腫瘤之一,5年生存率不到5％。胰腺癌肝轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致胰腺癌總體療效差的主要原因,80％的患者在確診時已發(fā)生局部浸潤或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,肝轉(zhuǎn)移發(fā)生率超過50％。對胰腺癌肝轉(zhuǎn)移目前還缺乏特別有效的藥物和治療方法。晚期胰腺癌放化療效果欠佳,清胰化積方(QYHJ)以清熱化濕為組方原則,運(yùn)用中西醫(yī)綜合治療模式在晚期胰腺癌患

2、者中取得了一定的療效。胰腺癌相關(guān)轉(zhuǎn)移因子在其癌周組織含量比較豐富,對此進(jìn)行的研究也是胰腺癌治療的一個重要方向。
　　目的
　　觀察清胰化積方(QYHJ)對人胰腺癌肝轉(zhuǎn)移的干預(yù)效應(yīng);對相關(guān)轉(zhuǎn)移因子的表達(dá)變化進(jìn)行檢測從而探究QYHJ在胰腺癌肝轉(zhuǎn)移治療中的可能作用機(jī)理。
　　方法
　　第一部分
　　采用人胰腺癌高肝轉(zhuǎn)移細(xì)胞株SW1990HM,通過脾臟注射法,建立人胰腺癌SW1990HM肝轉(zhuǎn)移裸鼠動物模型,將實驗分

3、為4組:生理鹽水組(NS)、QYHJ大、中、小三個劑量組(QYHJ-H、QYHJ-M、QYHJ-S)進(jìn)行干預(yù)。以體重變化、小鼠肝轉(zhuǎn)移發(fā)生數(shù)及肝轉(zhuǎn)移克隆數(shù)和肝轉(zhuǎn)移灶體積為觀察指標(biāo),觀察QYHJ干預(yù)后對生存質(zhì)量的影響及對肝轉(zhuǎn)移的抑制作用;評價QYHJ對肝轉(zhuǎn)移的干預(yù)作用是否具有劑量遞增效應(yīng)。
　　第二部分
　　清胰化積方(QYHJ)干預(yù)人胰腺癌肝轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究,主要從以下方面進(jìn)行:
　　1.RT-PCR檢測:將各組小鼠肝轉(zhuǎn)移

4、灶部分腫瘤新鮮組織,在液氮中研成細(xì)末,TotalRNA抽提后,進(jìn)行RT-PCR半定量檢測,觀察各組中MMPs、VEGF、cyr61、TGF-β1、bFGF等轉(zhuǎn)移相關(guān)因子的mRNA水平上的表達(dá)變化;
　　2.免疫組化檢測:根據(jù)RT-PCR的檢測結(jié)果,對mRNA水平表達(dá)有顯著差異的相關(guān)因子在組織水平進(jìn)行免疫組化檢測,從陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)觀察腫瘤組織中相關(guān)因子QYHJ干預(yù)后的變化及從陽性區(qū)域光密度面積判斷相關(guān)因子在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)變化。

5、r>　　3.探究各因子的表達(dá)變化與肝轉(zhuǎn)移灶增殖生長之間的相關(guān)性,并進(jìn)一步作回歸分析判斷與肝轉(zhuǎn)移灶增殖生長有直接相關(guān)的轉(zhuǎn)移因子。
　　4.westernblot檢測:取各組小鼠肝轉(zhuǎn)移灶部分腫瘤組織,總蛋白提取后進(jìn)行westernblot檢測,觀察與肝轉(zhuǎn)移灶增殖生長的相關(guān)因子表達(dá)變化,進(jìn)一步從分子水平驗證免疫組化的分析結(jié)果,明確QYHJ抑制胰腺癌肝轉(zhuǎn)移的作用靶點(diǎn)。
　　5.ELISA對各組血液中的CEA及CA19-9進(jìn)行檢測,觀

6、察QYHJ干預(yù)后的變化。
　　6.流式細(xì)胞術(shù)檢測QYHJ干預(yù)后各組的細(xì)胞周期變化及凋亡變化。
　　結(jié)果
　　第一部分
　　1.QYHJ各用藥組在第6周觀察結(jié)束時的裸鼠體重高于生理鹽水組(NS)體重(P＜0.05),其中尤以QYHJ高劑量(QYHJ-H)組更顯著(P＜0.01)。
　　2.QYHJ大、中、小劑量各組肝轉(zhuǎn)移發(fā)生率分別為57.1％(8/14)、42.8％(6/14)、60％(9/15)、NS組為7

7、3.3％(11/15);與NS比較,QYHJ大、中、小劑量組的肝轉(zhuǎn)移發(fā)生抑制率分別為22.1％、41.6％、18.1％。
　　3.與NS組相比,QYHJ大、中、小劑量組均顯著減少肝轉(zhuǎn)移克隆個數(shù)(P＜0.01);而QYHJ各組之間則無顯著差異(P＞0.05)。
　　4.與NS組相比,QYHJ各組均可抑制肝轉(zhuǎn)移灶的增殖生長(P＜0.05),大中小劑量組抑制率分別為45.5％、45.6％、24.6％。QYHJ各組之間比較,大中劑量

8、組的抑制率比小劑量組強(qiáng)(P＜0.05);大中劑量之間無差異(P＞0.05)。
　　第二部分
　　1.與NS組比較,QYHJ干預(yù)后,大、中、小劑量組的肝轉(zhuǎn)移灶腫瘤組織中bFGF的mRNA表達(dá)分別升高21.8％、47.1％、39.2％(P＜0.05),QYHJ大、中、小劑量組之間無明顯差異(P＞0.05);CTGFmRNA表達(dá)在大劑量組中下調(diào)9.61％、中、小劑量組分別升高11.5％、9.63％(VSNS,P＞0.05);MMP

9、-1的mRNA表達(dá)分別升高28.3％、12.2％、19.6％,(VSNS,P＞0.05);MMP-7的mRNA表達(dá)上調(diào),分別為18.2％、12.9％、1.3％(VSNS,P＞0.05)。MMP-9的mRNA表達(dá)變化分別下調(diào)7.4％、13.8％、11.2％(VSNS,P＞0.05)。
　　2.與NS組比較,QYHJ干預(yù)后,大、中、小劑量組的肝轉(zhuǎn)移灶腫瘤組織中cyr61的mRNA表達(dá)下調(diào)(P＜0.05),分別為57.9％、69.5％、

10、29.5％;MMP-2的mRNA表達(dá)下調(diào)(VSNS,P＜0.05),分別為42.1％、28.1％、62.3％;TGF-β1的mRNA表達(dá)下調(diào)(VSNS,P＜0.05),分別為78.6％、69.9％、33.1％;VEGF的mRNA表達(dá)下調(diào)(VSNS,P＜0.05),分別為78.9％、64.9％、43.8％。
　　3.各組肝轉(zhuǎn)移灶腫瘤組織可見細(xì)胞漿染色成棕褐色,細(xì)胞基質(zhì)問也可見棕褐染色。
　　4.NS組、QYHJ大、中、小劑量組

11、cyr61陽性細(xì)胞表達(dá)分別為39±10、21±3、23±4、32±6,QYHJ各組的cyr61陽性細(xì)胞表達(dá)下降(VSNS,P＜0.05);MMP-2陽性細(xì)胞表達(dá)分別為38+11、28+5、24±4、29+3,QYHJ各組的MMP-2陽性細(xì)胞表達(dá)下降(VSNS,P＜0.05);bFGF陽性細(xì)胞表達(dá)分別為45+8、65±5、64±9、56+6,QYHJ各組的bFGF陽性細(xì)胞表達(dá)增多(VSNS,P＜0.05);TGF-β1陽性細(xì)胞表達(dá)分別為4

12、7±10、31±4、29±3、36±6,QYHJ各組的TGF-β1陽性細(xì)胞表達(dá)下降(VSNS,P＜0.05);VEGF陽性細(xì)胞表達(dá)分別為42±7、32±4、29±5、32±5,QYHJ各組的VEGF陽性細(xì)胞表達(dá)下降(P＜0.05)。
　　5.NS組、QYHJ大、中、小劑量組cyr61陽性區(qū)域光密度分別為508.82±6.69、319.92±2.96、323.46±4.12、435.29±4.83;VEGF陽性區(qū)域光密度分別為447

13、.6±7.54、337.3±5.44、317.8±5.28、360.6±5.42;TGF-β1陽性區(qū)域光密度分別為748.66±10.12、435.23±4.77、418.17±5.26、658.41±6.33:bFGF陽性區(qū)域光密度分別為661.24±8.13、685.74±5.32、721.56±5.38、771.41±6.24;MMP-2陽性區(qū)域光密度分別為538.42±6.47、312.84±4.47、445.75±5.73、2

14、39.43±4.32;
　　6.相關(guān)性分析表明cyr61、MMP-2、VEGF、TGF-β1、bFGF的陽性表達(dá)與肝轉(zhuǎn)移灶增殖生長的相關(guān)性均為正相關(guān),分別為0.677、0.355、0.540、0.402、0.657
　　7.回歸分析結(jié)果提示,VEGF、bFGF、cyr61與轉(zhuǎn)移灶體積增殖有依存關(guān)系,回歸方程:y^=-0.954+0.026X1+0.023x2+0.027x3
　　8.westernblot檢測,從蛋白質(zhì)

15、分子水平進(jìn)一步驗證了mRNA水平和組織學(xué)水平的結(jié)果。QYHJ各組的VEGF、TGF-β1、cyr61、MMP-2表達(dá)均明顯低于NS組(P＜0.05),而bFGF的表達(dá)比NS組高(P＜0.05)。
　　9.ELISA檢測發(fā)現(xiàn)QYHJ-H、QYHJ-M、QYhJ-S各組的血液標(biāo)本中的CEA濃度均值分別為12.51±2.53ng/ml、13.67+2.72ng/ml、15.83±3.16ng/ml,OYHJ組明顯低于NS組的23.26±

16、4.62ng/ml(P＜0.05);NS、QYHJ-H、QYHJ-M、QYHJ-S各組肝轉(zhuǎn)移小鼠的血清CA19.9平均值分別是423.72+45.43U/ml、318.26+42.13U/m1、355.47±44.29U/ml、362.37±45.08U/ml,QYHJ組明顯低于NS組(P＜0.05)。
　　10.流式細(xì)胞術(shù)(FCM)結(jié)果:NS組胰腺癌肝轉(zhuǎn)移灶增殖指數(shù)為30.72％,QYHJ大、中、小劑量各組的細(xì)胞增殖指數(shù)分別為1

17、9.28％、21.14％及24.63％,均小于生理鹽水組(P＜0.05)。細(xì)胞周期各時相比較發(fā)現(xiàn),各中藥組的G0/G1期細(xì)胞均顯著高于NS對照組(P＜0.05),而QYHJ各組的G2/M期細(xì)胞比例低于生理鹽水對照組(P＜0.05)。QYHJ大、中、小各組的凋亡率比NS組要高,分別為15.29％、15.42％、11.89％,NS組凋亡率為7.47％,有顯著性差異(P＜0.05)。
　　結(jié)論
　　第一部分
　　1.QYHJ

18、能夠減少肝轉(zhuǎn)移克隆灶的形成,未見劑量遞增效應(yīng)。
　　2.QYHJ抑制肝轉(zhuǎn)移克隆灶的增殖生長,大、中劑量優(yōu)于小劑量,大劑量與中劑量之間無明顯差異。
　　3.QYHJ可以改善實驗動物的生存質(zhì)量,大劑量優(yōu)于中、小劑量,中劑量和小劑量之間無差異。
　　4.QYHJ對人胰腺癌SW1990HM肝轉(zhuǎn)移具有一定的抑制作用。
　　第二部分
　　1.QYHJ干預(yù)后可下調(diào)VEGF、MMP-2、cyr61、TGF-β1的mRNA表

19、達(dá)水平;下調(diào)腫瘤組織中癌細(xì)胞對cyr61、VEGF、MMP-2、TGF-β1的蛋白水平表達(dá);抑制癌組織中cyr61、VEGF、MMP-2、TGF-β1陽性細(xì)胞的產(chǎn)生。
　　2.QYHJ干預(yù)后在下調(diào)VEGF、cyr61、TGF-β1、MMP-2等相關(guān)轉(zhuǎn)移因子的同時,上調(diào)轉(zhuǎn)移相關(guān)因子bFGF的mRNA和蛋白表達(dá)水平,表明QYHJ對胰腺癌肝轉(zhuǎn)移的抑制作用是一個復(fù)雜的綜合效應(yīng)。
　　3.QYHJ干預(yù)胰腺癌肝轉(zhuǎn)移灶生長起最終作用的靶點(diǎn)