攜帶人HCN4與Tbx3基因慢病毒共轉(zhuǎn)染對胚胎干細(xì)胞生物學(xué)活性的影響.pdf

1、目的：
　　 電子起搏器的局限性促使人們在緩慢性心律失常的治療中尋找新的途徑和方法，體外重新構(gòu)建具有竇房結(jié)功能的細(xì)胞便是嘗試之一。目前主要以HCN4基因轉(zhuǎn)染干細(xì)胞，其雖能分化成心肌樣細(xì)胞，但由于缺乏竇房結(jié)標(biāo)記基因，功能上與竇房結(jié)細(xì)胞仍有差距。Tbx3基因在胚胎發(fā)育成熟晚期存在于竇房結(jié)前體細(xì)胞中使之保留起搏功能并抑制竇房結(jié)前體細(xì)胞向心房肌細(xì)胞分化。同時Tbx3與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)乳腺癌、膀胱癌、肝癌等惡性腫瘤都存在T

2、bx3基因的過表達(dá)。本研究擬構(gòu)建同時攜帶有人。HCN4基因、Tbx3基因及增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因(eGFP)的慢病毒顆粒，并研究HCN4和Tbx3對小鼠胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell，ES)細(xì)胞生物學(xué)活性的影響，為進(jìn)一步通過HCN4、Tbx3共表達(dá)重建竇房結(jié)細(xì)胞功能奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1、慢病毒包裝及滴度測定
　　 用脂質(zhì)體Lipofectamine2000分別包裹攜帶有目的基因的

3、hHCN4-hTbx3-eGFP、hHCN4-eGFP、hTbx3-eGFP、eGFP四種目的質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)染293 FT細(xì)胞，分別產(chǎn)生含有表達(dá)hHCN4-hTbx3-eGFP、hHCN4-eGFP、hTbx3-eGFP、eGFP基因的四種慢病毒顆粒，計數(shù)熒光克隆數(shù)目，并計算病毒滴度。
　　 2、干細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和篩選
　　 將獲得的四種慢病毒顆粒分別轉(zhuǎn)染小鼠ES細(xì)胞，48小時后于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果。將轉(zhuǎn)染成功

4、的細(xì)胞進(jìn)行傳代擴(kuò)增并進(jìn)行挑克隆純化，RT-PCR進(jìn)一步檢測目的基因表達(dá)情況。
　　 3、ES細(xì)胞生物學(xué)活性的評價
　　 觀察獲得的四種轉(zhuǎn)基因小鼠ES細(xì)胞的形態(tài)、熒光表達(dá)強(qiáng)度。MTT法測定各組ES細(xì)胞OD值，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率。
　　 結(jié)果：
　　 1、hHCN4-hTbx3慢病毒顆粒的構(gòu)建
　　 四質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293 FT細(xì)胞后，根據(jù)熒光顯微鏡觀察結(jié)果表明成功構(gòu)建hHCN4-hTbx3-eGFP

5、、hHCN4-eGFP、hTbx3-eGFP、eGFP四種慢病毒顆粒。病毒滴度測定結(jié)果分別為4.7×107TU/ml、5.2×107TU/ml、4.5×107TU/ml、6.7×107TU/ml。
　　 2、轉(zhuǎn)基因ES細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)檢測
　　 四種慢病毒轉(zhuǎn)染后的ES細(xì)胞挑克隆純化后熒光表達(dá)正常，RT-PCR示目的基因表達(dá)良好。
　　 3、ES細(xì)胞形態(tài)、凋亡等變化
　　 四種轉(zhuǎn)染小鼠ES細(xì)胞中，含hHC

6、N4-eGFP及eGFP細(xì)胞形態(tài)良好，熒光率較高，含hTbx3-eGFP和hHCN4-hTbx3-eGFP細(xì)胞狀態(tài)相對差，熒光雖然明顯，但表達(dá)不強(qiáng)，培養(yǎng)上清可見漂浮的死細(xì)胞。進(jìn)一步的MTT和流式細(xì)胞儀(AnnexinV-PE)檢測示hTbx3-eGFP、hHCN4-hTbx3兩組細(xì)胞生長速度明顯減慢，凋亡率顯著增高(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.成功構(gòu)建出HCN4-Tbx3基因的慢病毒顆粒。
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