棉花Cu-Zn-SOD基因的克隆與表達(dá)的初步研究.pdf

1、本文初步研究了棉花Cu/Zn-SOD基因的克隆與表達(dá)。 (1)以短季棉早熟不早衰品種中棉所36真葉為材料，對(duì)其進(jìn)行傷誘導(dǎo)和高溫處理，然后提取總RNA，得到cDNA，以處理葉片的cDNA為模板，利用RACE技術(shù)，克隆了在棉花SOD酶活中占比例最大的Cu/ZnSOD基因(約占86％)，該基因包括兩個(gè)：葉綠體Cu/ZnSOD基因和胞質(zhì)Cu/ZnSOD基因。其中葉綠體Cu/ZnSOD基因的注冊(cè)號(hào)為DQ120514，基因序列長度1043b

2、p，包含一個(gè)645bp的開放閱讀框，起始于98位終止于745位，編碼215個(gè)氨基酸。在棉花基因中是兩個(gè)拷貝，棉花葉綠體Cu/ZnSOD蛋白與其它植物的葉綠體Cu/ZnSOD蛋白的氨基酸同源性為65.7％～81％。棉花葉綠體Cu/ZnSOD蛋白質(zhì)的分子量為25.0KD,等電點(diǎn)為6.11。該蛋白質(zhì)具有兩個(gè)酶活性中心，位于葉綠體的基質(zhì)中，是個(gè)球蛋白。胞質(zhì)Cu/ZnSOD基因的注冊(cè)號(hào)為DQ445093，基因序列長度682bp,包含一個(gè)456bp

3、的開放閱讀框，起始于120位終止于578位，編碼152個(gè)氨基酸。在棉花基因中是一個(gè)拷貝，棉花胞質(zhì)Cu/ZnSOD蛋白與其它植物的胞質(zhì)Cu/ZnSOD蛋白的氨基酸同源性為81％～87％。棉花葉綠體Cu/ZnSOD蛋白質(zhì)的分子量為15.03KD，等電點(diǎn)為6.09。該蛋白質(zhì)具有兩個(gè)酶活性中心，位于細(xì)胞質(zhì)中，是個(gè)球蛋白。 (2)基因表達(dá)分析表明：葉綠體Cu/ZnSOD基因在幼嫩的莖、花中有微量的表達(dá)，在葉片中高效表達(dá)；在中棉所36的苗期

4、、始花期、盛花期、鈴期和吐絮期分別采真葉提取RNA檢測(cè)葉綠體Cu/ZnSOD基因的表達(dá)結(jié)果顯示：基因在苗期表達(dá)較低，到初花期到達(dá)最高，然后表達(dá)量下降。 胞質(zhì)Cu/ZnSOD基因表達(dá)活性在根中最高，其次為葉片，下胚軸，花和莖的表達(dá)較弱。說明胞質(zhì)Cu/ZnSOD基因主要在根和葉片中表達(dá)；在整個(gè)棉花生育期中呈現(xiàn)有規(guī)律的動(dòng)態(tài)變化，從苗期開始基因表達(dá)逐漸增強(qiáng)，到盛花期達(dá)到頂峰，以后逐漸下降;但是從整個(gè)生育期觀察，后期的活性比前期高。

5、 (3)棉花葉綠體Cu/ZnSOD基因的原核表達(dá)檢測(cè)：在基因的起始密碼子和終止子處設(shè)計(jì)一對(duì)引物，以cDNA為模板擴(kuò)增得到完整的基因全長，然后，構(gòu)建中間重組子pUC-1-SOD；再構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-Cu/Zn-SOD，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化菌株比對(duì)照組SOD酶活增高17％，顯示表達(dá)產(chǎn)物具有SOD酶的活性。 (4)棉花葉綠體Cu/ZnSOD基因的植物轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建：在基因的起始密碼子和終止子處設(shè)計(jì)一對(duì)引物，以cDNA為